張勝忠 胡曉輝 楊 珍 徐 勝 郭進(jìn)濤 侯 剛 張智猛苗華榮*陳 靜*

(1.山東省花生研究所,山東 青島 266100;2.安徽省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,安徽 合肥 230001;3.新鄭市和莊鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,河南 鄭州 451150;4.鐵嶺市農(nóng)科院,遼寧 鐵嶺 112616)

花生(ArachishypogaeaL.,2n=4X=40)是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物,常年種植面積約5×106hm2,總產(chǎn)1.6×1010kg左右,花生高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)對(duì)保障我國(guó)植物油脂和蛋白的安全供給具有重要意義?；ㄉ讶十a(chǎn)量,受莢果產(chǎn)量和出仁率影響。出仁率是花生單株產(chǎn)量的直接決定因素之一[1-2],是影響花生制品脫殼加工的重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)[3]。開(kāi)展出仁率相關(guān)基因/QTL 定位和分子標(biāo)記輔助選擇(marker assisted selection,MAS),對(duì)揭示花生出仁率遺傳機(jī)制和開(kāi)展花生高產(chǎn)分子育種具有重要意義。

在花生產(chǎn)量相關(guān)性狀的研究中,多數(shù)集中于莢果或種子大小和種子質(zhì)量[4-6]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外在花生出仁率相關(guān)基因/QTL定位方面也取得一些進(jìn)展。Faye 等在不同水分脅迫條件下利用TAG 24×ICGV 86031 雜交衍生重組自交系群體定位到2個(gè)出仁率相關(guān)QTL,表型變異貢獻(xiàn)率(phenotypic variation explained,PVE)為5.74%～6.97%[7]。Huang等利用一個(gè)F2:3群體,定位到3 個(gè) 出 仁 率 相 關(guān)QTL,qKPA5、qKPA7 和qKPA9,PVE范圍為2.00%～11.78%[8]。蔡巖等利用遠(yuǎn)雜9102×徐州68-4雜交衍生的RIL 群體構(gòu)建了包含365 個(gè)SSR 標(biāo)記的連鎖圖,基于2年出仁率表型數(shù)據(jù),檢測(cè)到22個(gè)QTL,其中包括4個(gè)主效QTL[3]。Luo等利用830個(gè)標(biāo)記和4年RIL群體出仁率數(shù)據(jù),定位到25 個(gè)QTL,其中cqSPA9在4個(gè)環(huán)境下均穩(wěn)定表達(dá),表型貢獻(xiàn)率為10.47%～17.01%[9],利用QTL-seq明確了qSPA9的基因組區(qū)間為66.75～69.50 Mb[10]。陳偉剛等檢測(cè)到2 個(gè)出仁率主效QTL,qSPA5和qSPA9.1,其中qSPA9.1位點(diǎn)可以同時(shí)調(diào)控花生出仁率和株高[2]。Jiang等利用花生核心種質(zhì),通過(guò)關(guān)聯(lián)分析在3個(gè)環(huán)境中分別檢測(cè)到5個(gè)、2個(gè)和2個(gè)控制出仁率的等位基因,解釋表型變異范圍1.43%～2.98%[11]?？傮w而言,花生出仁率相關(guān)QTL 研究依然不足,特別是穩(wěn)定主效位點(diǎn)較少,仍然需要定位和挖掘新位點(diǎn)。

隨著花生栽培種的基因組序列陸續(xù)公布[12-14],以栽培種花生基因組為參考,進(jìn)行相關(guān)基因/QTL定位與相關(guān)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)將更加準(zhǔn)確和有效。本研究以花育36號(hào)×6-13雜交衍生的181個(gè)F2:9代重組自交系為試驗(yàn)材料,基于2個(gè)環(huán)境下出仁率表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位分析,為后續(xù)相關(guān)基因精細(xì)定位和分子育種改良出仁率性狀提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以花育36號(hào)×6-13構(gòu)建的重組自交系群體(F2:9)為試驗(yàn)材料,該群體包含181 個(gè)家系。母本花育36號(hào)為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗逆大花生品種,出仁率較高;父本6-13為高油品系,出仁率較低。

1.2 田間種植

2019年將試驗(yàn)材料分別種植于山東省花生研究所試驗(yàn)基地(E1:120.53°E,36.86°N)和山東省東營(yíng)市黃河三角洲現(xiàn)代農(nóng)業(yè)試驗(yàn)示范基地(E2:118.49°E,37.46°N)。種植方式為起壟雙行單粒覆膜播種,壟距85 cm。每個(gè)家系種植1行,每行種植10株,株距15 cm,每隔20行(即10壟)種植1壟親本(父、母本各1行),設(shè)3次重復(fù)。田間水肥管理等同于常規(guī)大田,及時(shí)進(jìn)行病蟲(chóng)害防治。成熟后及時(shí)收獲晾曬,選擇每個(gè)家系中間8株用于莢果出仁率檢測(cè)。

1.3 出仁率測(cè)定和數(shù)據(jù)處理

分別測(cè)定親本和RIL 群體各家系成熟莢果質(zhì)量和籽仁質(zhì)量,計(jì)算出仁率,每個(gè)家系至少測(cè)定3次重復(fù),取平均值。莢果出仁率計(jì)算公式:KP=KM/PM×100%,其中KP代表出仁率(kernel percentage),KM 代表籽仁質(zhì)量(kernel mass),PM 代表相應(yīng)莢果質(zhì)量(pod mass)。

利用SPSS軟件(IBM?SPSS?statistics 19)獲得群體出仁率平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最小值、最大值、偏度、峰度,利用QTL IciMapping V4.1[15]進(jìn)行方差估算,用于廣義遺傳率的計(jì)算。廣義遺傳率計(jì)算公式:h2=σg2/(σg2+σge2/n+σε2/nr),其中h2代表廣義遺傳率,σg2代表基因型方差,σge2代表基因型與環(huán)境互作方差,σε2代表誤差方差,n代表環(huán)境數(shù),r代表單一環(huán)境下重復(fù)數(shù)。

1.4 QTL定位

本實(shí)驗(yàn)室前期基于該RIL群體構(gòu)建了一張高密度SLAF-seq遺傳圖譜,共包含3866個(gè)SNP和SSR標(biāo)記,覆蓋20個(gè)連鎖群,總圖距1266.87 cM[16]。利用QTL IciMapping V4.1軟件,采用完備區(qū)間作圖法對(duì)出仁率相關(guān)QTL進(jìn)行定位分析。采用該軟件BIP功能模塊,定位單環(huán)境下相關(guān)QTL,以LOD大于3作為存在閾值,加性效應(yīng)的正和負(fù)代表增效等位基因分別來(lái)自6-13和花育36號(hào)。采用該軟件MET功能模塊,定位多環(huán)境下相關(guān)加性和上位性QTL,分別以LOD大于3和5作為存在加性QTL和上位性QTL的閾值。主效應(yīng)QTL的命名規(guī)則為:q+性狀(kernel percentage,KP)+染色體數(shù)。上位性QTL的命名規(guī)則為:eq+性狀(kernel percentage,KP)+染色體數(shù)+同一染色體上的次序。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本和群體出仁率表型分析

在E1、E2兩環(huán)境下,母本花育36號(hào)的出仁率分別為79.62%和75.04%,父本6-13的出仁率分別為61.84%和55.63%,親本間出仁率相差至少10個(gè)百分點(diǎn),存在顯著差異(表1)。在E1環(huán)境下,RIL群體出仁率變異范圍為42.53%～84.88%,在E2環(huán)境下變異范圍為41.15%～85.25%,兩個(gè)環(huán)境下均存在廣泛的遺傳變異,且表現(xiàn)為超親遺傳(圖1,表1)。方差分析表明,基因型、環(huán)境、基因型與環(huán)境間互作均能顯著影響表型變異,廣義遺傳率為0.79(表2),由此可見(jiàn),出仁率性狀主要受遺傳因素影響,但環(huán)境因素也不可忽略。

2.2 單環(huán)境分析定位出仁率QTL

采用復(fù)合區(qū)間作圖法,結(jié)合2個(gè)環(huán)境表型數(shù)據(jù),定位出仁率相關(guān)QTL?；赒TL IciMapping V4.1軟件的BIP功能模塊進(jìn)行單環(huán)境QTL定位分析,在2 個(gè)環(huán)境下共檢測(cè)到6 個(gè)主效應(yīng)QTL(main-effect QTL),分布于第7、8、9、13、16、18連鎖群上,表型貢獻(xiàn)率為4.20%～15.14%(圖2,表3)。在E1環(huán)境下,檢測(cè)到3 個(gè)QTL,分別為qKP7、qKP9和qKP13,LOD值范圍3.04～7.68,PVE范圍5.49%～15.14%。在E2環(huán)境下,檢測(cè)到5個(gè)QTL,分 別 為qKP7、qKP8、qKP9、qKP16 和qKP18,LOD值范圍3.50～11.15,PVE范圍4.20%～14.41%。其中qKP7 和qKP9 在兩個(gè)環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá),且qKP7 為主效QTL(major QTL,PVE＞10%),增效等位基因分別來(lái)自親本6-13和花育36號(hào) (表3)。

圖1 RIL群體出仁率性狀表型Fig.1 Phenotypic distribution of the kernel percentage in the RIL population

表1 親本和RIL群體莢果出仁率表型統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of kernel percentage in parents and the RIL population

表2 RIL群體莢果出仁率性狀方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) for the trait of kernel percentage in the RIL population

2.3 多環(huán)境聯(lián)合分析定位出仁率QTL

圖2 不同環(huán)境下出仁率相關(guān)QTL定位Fig.2 QTL mapping for kernel percentage in different environments

表3 單環(huán)境分析定位出仁率QTLTable 3 QTL identification for kernel percentage by individual environment analysis

表4 多環(huán)境聯(lián)合分析定位出仁率相關(guān)QTLTable 4 QTL identification for kernel percentage by multi-environmental joint analysis

為分析QTL 加性效應(yīng)、加性與環(huán)境的互作效應(yīng)對(duì)出仁率影響,采用QTL IciMapping V4.1軟件的MET 功能模塊進(jìn)行多環(huán)境聯(lián)合分析。由表4可以看出,共檢測(cè)到6個(gè)加性QTL,分別為qKP7、qKP8、qKP9、qKP13、qKP16和qKP18,PVE范圍為2.91%～15.82%。加性效應(yīng)對(duì)表型的總貢獻(xiàn)率為38.57%,加性QTL與環(huán)境互作對(duì)表型總貢獻(xiàn)率為4.13%(表4),可見(jiàn)加性效應(yīng)對(duì)出仁率遺傳起主要作用。其中qKP16與環(huán)境互作對(duì)表型貢獻(xiàn)率相對(duì)較大,為2.13%,表明該位點(diǎn)的表達(dá)易受環(huán)境影響。基于區(qū)間側(cè)翼標(biāo)記物理位置,發(fā)現(xiàn)這些QTL 的區(qū)間大小范圍為0.46～6.00 Mb,其中主效位點(diǎn)qKP7物理區(qū)間僅0.60 Mb,有助于后續(xù)進(jìn)行對(duì)該位點(diǎn)的精細(xì)定位和候選基因的鑒定。

2.4 出仁率相關(guān)上位性互作分析

為分析上位性互作對(duì)出仁率的影響,利用QTL IciMapping V4.1軟件的MET 功能模塊進(jìn)行上位性QTL檢測(cè)。由圖3和表5可以看出,共檢測(cè)到6對(duì)上位性QTL,共涉及10個(gè)位點(diǎn),分別位于第3、7、11、12、15、16、17、18染色體,LOD 值的范圍為5.18～6.30,上位性互作對(duì)表型變異貢獻(xiàn)率為2.90%～4.58%。其中,eqKP11.1 與eqKP13之間的互作效應(yīng)對(duì)表型變異貢獻(xiàn)率最大,為4.58%;eqKP11.2與eqKP18之間的互作效應(yīng)對(duì)表型變異貢獻(xiàn)率最小,為2.90%。位點(diǎn)eqKP7和eqKP11.2均分別與2 個(gè)不同基因組位點(diǎn)存在上位性互作。上位性位點(diǎn)eqKP7(Marker4243-Marker4263) 與加性位點(diǎn)qKP7(Marker4240-Marker4243)區(qū)間存在重疊,可能是同一位點(diǎn)。另外,發(fā)現(xiàn)部分上位性QTL 與環(huán)境間存在互作,總貢獻(xiàn)率為0.49%(表5),表明基因間互作對(duì)出仁率調(diào)控受環(huán)境影響較小。

圖3 出仁率性狀相關(guān)上位性QTL分析Fig.3 Analysis of epistatic QTL associated with kernel percentage

表5 出仁率相關(guān)上位性QTL定位Table 5 Epistatic QTL identification for kernel percentage

3 討論與結(jié)論

本研究中花育36號(hào)和6-13的出仁率性狀存在顯著差異,表明兩親本調(diào)控出仁率的遺傳基礎(chǔ)存在差異。RIL群體在2個(gè)環(huán)境下均存在廣泛的遺傳變異,表現(xiàn)為超親遺傳,表明來(lái)自雙親的等位基因在RIL群體中發(fā)生了充分的基因重組,這不僅有助于后續(xù)QTL 定位分析,同時(shí)有助于培育出仁率性狀優(yōu)良的品系/品種。前人研究表明出仁率屬于數(shù)量性狀,遺傳機(jī)制復(fù)雜,易受環(huán)境影響[2-3]。本研究中出仁率的廣義遺傳率為0.79,表明出仁率性狀主要受遺傳因素影響,但環(huán)境因素也不可忽略。

本研究共檢測(cè)到6 個(gè)主效應(yīng)QTL,其中qKP7和qKP9在2個(gè)環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá),物理位置分別為0.21～0.81Mb和101.75～107.75Mb(表4)。qKP7 為主效位點(diǎn),對(duì)表型變異貢獻(xiàn)率較大(PVE＞10%),qKP7與環(huán)境互作效應(yīng)較小(PVE=0.13%),因此該位點(diǎn)可作為后續(xù)基因精細(xì)定位和分子聚合育種的‘靶標(biāo)’位點(diǎn)。Luo等在第9染色體上定位到一個(gè)穩(wěn)定主效位點(diǎn)cqSPA9,物理區(qū)間為66.75～69.50 Mb[9-10],與本研究中qKP9物理位置相距較遠(yuǎn),推測(cè)兩者不是同一位點(diǎn)。Huang等在第7和第9連鎖群上檢測(cè)出仁率相關(guān)QTL,qSPA7(PVE=11.78%)和qSPA9(PVE=2.00%)[8]。陳偉剛等在第9連鎖區(qū)也定位到一個(gè)控制出仁率的穩(wěn)定主效位點(diǎn)qSPA9.1,PVE范圍為11.72%～14.79%[2]。由于無(wú)法明確這些位點(diǎn)在花生栽培種基因組的位置及缺乏共有標(biāo)記,因此難以與本研究的定位結(jié)果相比較。除穩(wěn)定表達(dá)的qKP7和qKP9位點(diǎn)外,本研究還檢測(cè)到一些環(huán)境特異表達(dá)的位點(diǎn),如qKP16,其與環(huán)境互作效應(yīng)對(duì)表型貢獻(xiàn)率達(dá)2.13%,這解釋了出仁率易受環(huán)境影響的現(xiàn)象。

復(fù)雜性狀的基因表達(dá)往往存在上位性作用,單純主效應(yīng)QTL 定位不能真實(shí)反映QTL 對(duì)性狀的調(diào)控效應(yīng)[2,17-18]。本研究共定位到6對(duì)上位性互作QTL,共涉及10個(gè)位點(diǎn),其中eqKP7和eqKP11.2均分別參與2對(duì)上位性互作,表明花生出仁率遺傳存在復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。另外,比較上位性QTL 和加性QTL 定位結(jié)果,發(fā)現(xiàn)eqKP7與qKP7區(qū)間存在重疊,表明該位點(diǎn)不僅可以直接調(diào)控花生出仁率,也可與其他位點(diǎn)互作影響該性狀。傳統(tǒng)的MAS往往針對(duì)效應(yīng)較大位點(diǎn)進(jìn)行選擇,本研究中上位性互作以及微效QTL對(duì)表型貢獻(xiàn)率較小,不滿足實(shí)現(xiàn)MAS的要求,對(duì)此可采用基因組選擇策略(genomic selection,GS)[19],即考慮全基因組標(biāo)記對(duì)性狀的遺傳效應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微效位點(diǎn)的利用。

本研究基于RIL群體2個(gè)環(huán)境下表型數(shù)據(jù),鑒定了6個(gè)出仁率相關(guān)主效應(yīng)QTL 和6對(duì)上位性位點(diǎn),明確了不同遺傳效應(yīng)對(duì)花生出仁率性狀的影響,為后續(xù)花生高產(chǎn)分子育種研究提供了重要基礎(chǔ)。