周麗思 郭順星

摘要?目的：調(diào)查云南省大葉千斤拔（Flemingia macrophylla）與細(xì)葉千斤拔（Flemingia lineata）根內(nèi)叢枝菌根真菌（Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF）群落結(jié)構(gòu)多樣性。方法：使用巢式-PCR、克隆、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）分析及測(cè)序技術(shù)。結(jié)果：共獲得558個(gè)含有叢枝菌根真菌18S rRNA片段的克隆子，經(jīng)RFLP分析后得到83個(gè)RFLP類(lèi)型，DNA序列分析可將其劃分為23個(gè)可操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units，OTUs），分屬于5個(gè)科，Glomeraceae為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。在MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)后，23個(gè)OTUs可鑒定為18個(gè)虛擬分類(lèi)分子種，分布于13種不同的生境。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌群落組成比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)論：比較大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌群落差異，結(jié)合叢枝菌根真菌在生態(tài)系統(tǒng)中的分布特點(diǎn)，為種植千斤拔屬植物的選址提供有力地環(huán)境指標(biāo)數(shù)據(jù)，并為篩選促生菌株提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞?千斤拔屬;叢枝菌根真菌;多樣性;分布;分子鑒定;巢式-PCR;限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析;可操作分類(lèi)單元

Identification of Arbuscular Mycorrhizal Fungi of Flemingia macrophylla and Flemingia lineata in Yunnan， Based on 18S rRNA Sequences

ZHOU Lisi， GUO Shunxing

（ Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193， China ）

Abstract?Objective：To investigate the community diversify of arbuscular mycorrhizal fungi（AMF） of Flemingia macrophylla and Flemingia lineata.Methods：The nested-PCR， cloning， RFLP analyzing and sequencing techniques were used.Results：A total of 558 clones containing 18S rRNA genes from AMF were obtained.After RFLP analysis， 83 different RFLP types were obtained， which can be divided into 23 Operational Taxonomic Units （OTUs） by DNA sequence analysis.They belonged to 5 subjects， and Glomeraceae was the dominant group.After they were compared in MaarjAM database， 23 OTUs could be identified as 18 molecular virtual taxon， scattered in 13 different habitats.By statistical analysis， AMF communities were significantly different between F.macrophylla and F.lineata roots， the difference was statistically significant （P<0.001）.Conclusion：Compared with the difference of AMF community in F.macrophylla and F.lineata roots， combining with the distribution features of AMF species in ecosystem， valuable environmental indicator data to choose site for the Flemingia plantation is provided.

Keywords?Flemingia; Arbuscular mycorrhiza; Diversity; Distribution; Molecular identification; Nest-PCR; RFLP; Operational taxonomic unit

中圖分類(lèi)號(hào)：R282.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.002

千斤拔屬（Flemingia）植物多為灌木或亞灌木，全球有40余種，主要分布于亞洲、非洲、大洋洲的熱帶地區(qū)，我國(guó)有16種及1變種[1]。2015版《中華人民共和國(guó)藥典》收載千斤拔藥材來(lái)源為豆科植物蔓性千斤拔Flemingia pholippinensis、大葉千斤拔Flemingia macrophylla和繡毛千斤拔Flemingia ferruginea的干燥根。此外，《中國(guó)植物志》《現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典》和《藥用植物詞典》中指出大部分千斤拔屬植物均可供藥用。千斤拔及相關(guān)中成藥產(chǎn)品主要用于婦科疾病、風(fēng)濕痹痛、體虛貧血、坐骨神經(jīng)痛、咽喉腫痛、跌打損傷等方面的治療[2-3]。分離自千斤拔屬植物的化合物主要包括黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、甾體類(lèi)、蒽醌類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等[4]，其中異戊烯基取代黃酮類(lèi)成分是千斤拔屬植物的主要成分和特征成分[5]。相關(guān)藥理研究表明黃酮類(lèi)化合物具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟及心血管系統(tǒng)的活性[6-7];萜類(lèi)與甾類(lèi)等化合物具有抗菌驅(qū)蟲(chóng)、抗氧化等作用[8]。隨著千斤拔相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，市場(chǎng)需求量日益增大，千斤拔屬植物的人工繁殖勢(shì)在必行，我國(guó)已相繼開(kāi)展了種子繁殖、離體繁殖、扦插繁殖等千斤拔人工栽培技術(shù)研究。有研究表明，千斤拔屬植物有效成分的積累與種質(zhì)資源和環(huán)境條件都息息相關(guān)[9-10]。叢枝菌根真菌作為與植物關(guān)系最為密切的土壤微生物，可與絕大多數(shù)植物形成共生體，從而影響植株的生長(zhǎng)微環(huán)境[11]。

叢枝菌根真菌作為“生物肥料”已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物生產(chǎn)[12]，其不僅改善植物營(yíng)養(yǎng)狀況、促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分元素的吸收和代謝、同時(shí)提高植物對(duì)不良環(huán)境和病蟲(chóng)害的抵抗能力。因此，叢枝菌根真菌在藥用植物栽培，尤其是根、莖為主要藥用部位的藥用植物人工繁殖方面的應(yīng)用研究也逐漸受到關(guān)注。相關(guān)研究表明，接種叢枝菌根真菌之后，可提高半夏塊莖中鳥(niǎo)苷、生物堿等化學(xué)成分含量[13];可以顯著提高川黃柏幼苗的小檗堿含量[14];可增加北柴胡皂苷A和地上部分黃酮含量[15]。明確原生地藥用植物根內(nèi)叢枝菌根真菌群落組成，將有助于了解該植物與土壤微生物處于最佳關(guān)系時(shí)的微生物群落結(jié)構(gòu)，為優(yōu)化人工栽培環(huán)境提供有力地理論依據(jù)。

得益于分子生物學(xué)技術(shù)日益成熟，對(duì)不可純培養(yǎng)的叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)的鑒定方法也不僅限于對(duì)根外孢子的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)顯微觀察法，根內(nèi)叢枝菌根真菌群落組成亦成為關(guān)注焦點(diǎn)[16]。前者可獲得優(yōu)質(zhì)的叢枝菌根真菌種質(zhì)資源便于開(kāi)展應(yīng)用研究，后者可直接獲得根內(nèi)叢枝菌根真菌的群落結(jié)構(gòu)信息，真實(shí)反應(yīng)與植物直接發(fā)生作用的叢枝菌根真菌種類(lèi)[17]。本文分別以2015版《中華人民共和國(guó)藥典》收載物種大葉千斤拔和非藥典收載的藥用物種細(xì)葉千斤拔為研究對(duì)象，通過(guò)根內(nèi)叢枝菌根真菌18s rRNA克隆文庫(kù)構(gòu)建及RFLP分析，考察二者根系中叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)及其種屬間的差異，旨在為解決千斤拔栽培中的相關(guān)問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?樣品采集及處理?大葉千斤拔和細(xì)葉千斤拔樣品均于2012年1月采自景洪至勐?？h的G214國(guó)道沿途。見(jiàn)表1。采樣地位于云南省西雙版納傣族自治州，地處北回歸線以南的熱帶北部邊緣，全年干濕季分明，降雨主要集中在5月下旬至10月下旬，全年平均降雨量為1 557 mm，全年平均氣溫為21.5 ℃，屬熱帶季風(fēng)氣候[18]。隨機(jī)選取植株生長(zhǎng)的3個(gè)地點(diǎn)，在根圍選擇5個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)采集一份根系樣本，將5個(gè)采樣點(diǎn)的根系樣品混合后作為該生長(zhǎng)地點(diǎn)的一份根系樣品。在距植株30～50 cm處采集20～30 cm深處的土樣和細(xì)根樣，編號(hào)、裝入自封袋后置入冰盒帶回。將根系樣品清洗干凈后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。土樣風(fēng)干保存。

1.2?叢枝菌根侵染相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.2.1?侵染強(qiáng)度的測(cè)定?每份根系樣品選取30個(gè)1 cm左右的幼嫩根系，經(jīng)0.05%曲利苯藍(lán)染色后，在顯微鏡下測(cè)定侵染率。根據(jù)菌根侵染分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和叢枝泡囊豐度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)根段進(jìn)行侵染率級(jí)別判斷，使用“MYCOCALC”軟件，計(jì)算侵染強(qiáng)度（M%），該指標(biāo)是真菌侵入植物根系的頻度與強(qiáng)度的綜合反應(yīng)[19]。

1.2.2?菌絲密度的測(cè)定?稱(chēng)取5 g過(guò)1 mm篩的土壤樣品，采用雙層篩過(guò)濾法提取根外菌絲至微孔濾膜上，0.05%曲利苯藍(lán)染色后觀察菌絲[20]。每張微孔濾膜上選取均勻分布的25個(gè)樣點(diǎn)進(jìn)行觀察、統(tǒng)計(jì)[19]。

1.2.3?孢子密度的測(cè)定?稱(chēng)取10 g風(fēng)干土樣，濕篩傾析-蔗糖離心法分離叢枝菌根真菌孢子，在體視顯微鏡下計(jì)數(shù)[20]。

1.3?根內(nèi)叢枝菌根真菌分子多樣性

1.3.1?根系樣品DNA的提取?取約200 mg根系樣品，經(jīng)表面消毒后（75%乙醇30 s、1%次氯酸鈉3 min、無(wú)菌水沖洗3次），用CTAB法提取植物基因組試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，中國(guó)，批號(hào)：181953）并按照操作手冊(cè)進(jìn)行根系樣品DNA提取，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2?巢式PCR擴(kuò)增?為更全面地獲得根內(nèi)叢枝菌根真菌群落組成，第1次PCR所用引物為叢枝菌根真菌特異引物AML1/AML2[22]表2、擴(kuò)增模版為根系樣品總DNA，第2次PCR所用引物為叢枝菌根真菌特異引物NS31/AM1[23-24]、擴(kuò)增模版為稀釋1 000倍后的第1次PCR產(chǎn)物。按照EasyTaq KIT說(shuō)明書(shū)（北京全式金生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，批號(hào)：G21017）依次進(jìn)行PCR反應(yīng)。2次PCR產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。每份DNA樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.3.3?RFLP分析與克隆文庫(kù)構(gòu)建?合并每份樣品的3個(gè)技術(shù)重復(fù)的PCR產(chǎn)物，并使用膠回收試劑盒進(jìn)行純化（北京艾德萊生物科技有限公司，中國(guó)），純化產(chǎn)物用于構(gòu)建叢枝菌根真菌18S rRNA克隆文庫(kù)（共6個(gè)文庫(kù)）。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增后，用HinfI（Fermentas，立陶宛）進(jìn)行RFLP分析。使用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)并劃分RFLP譜型，RFLP譜型僅在同一克隆文庫(kù)內(nèi)比較，不合并不同克隆文庫(kù)間的RFLP譜型。每一RFLP譜型隨機(jī)挑取一個(gè)克隆子進(jìn)行DNA序列測(cè)定（蘇州金唯智生物科技有限公司，中國(guó)），若測(cè)序結(jié)果不好或不能測(cè)出的克隆，則選取相同RFLP類(lèi)型的另一克隆子進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4?序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建?使用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線比對(duì)，去除非叢枝菌根真菌序列。利用DUTOR軟件按序列相似水平進(jìn)行序列類(lèi)群劃分，相似性大于97%的序列劃分為同一相似水平的OTUs。按所劃分的可操作分類(lèi)單元對(duì)Shannon多樣性指數(shù)（H′）、相對(duì)多度（Relative Abundance）、重要值（Important Values）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[20]。采用ClusterX軟件對(duì)代表序列與參考序列處理后，用Mega7.0軟件進(jìn)行Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育分析。隨后，將本研究所獲得的代表序列與MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)[25]（http：//maarjam.botany.ut.ee）進(jìn)行比對(duì)，序列相似度大于97%鑒定為一個(gè)分子虛擬分類(lèi)種（Molecular Virtual Taxon）。

1.4?數(shù)據(jù)處理?采用Microsoft Excel 2017軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)大葉千斤拔和細(xì)葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌侵染率、孢子密度、菌絲密度等數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（LSD法），使用Fisher確切概率法對(duì)大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌序列類(lèi)群對(duì)應(yīng)克隆數(shù)及不同科叢枝菌根真菌的差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)[26-27]。

2?結(jié)果與分析

2.1?根際叢枝菌根真菌概況?大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根際叢枝菌根真菌的侵染強(qiáng)度、孢子密度和菌絲密度等數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。大葉千斤拔除了菌絲密度與細(xì)葉千斤拔比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，侵染強(qiáng)度和孢子密度均顯著低于細(xì)葉千斤拔。

2.2?根內(nèi)叢枝菌根真菌克隆文庫(kù)的構(gòu)建及其群落多樣性分析?全部大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根系樣品均成功擴(kuò)增出根內(nèi)叢枝菌根真菌18S rRNA序列。采樣點(diǎn)分別建立克隆文庫(kù)。見(jiàn)表4。每個(gè)物種有3個(gè)采樣點(diǎn)樣本，每個(gè)樣本選出94個(gè)陽(yáng)性克隆，2個(gè)物種3個(gè)采樣點(diǎn)樣本的總克隆數(shù)均為282個(gè)，測(cè)序后舍去非叢枝菌根真菌序列。大葉千斤拔樣品克隆文庫(kù)獲得276個(gè)克隆，細(xì)葉千斤拔樣品獲得282個(gè)克隆?？寺∥膸?kù)的覆蓋度均在97%以上，可以較好地代表各樣本中叢枝菌根真菌的多樣性。

通過(guò)RFLP條帶類(lèi)型，進(jìn)一步劃分克隆子類(lèi)型;大葉千斤拔樣本有48個(gè)RFLP條帶類(lèi)型，細(xì)葉千斤拔樣本有35個(gè)，共獲得83條測(cè)序結(jié)果。按97%相似度劃分可操作分類(lèi)單元（OTU），共劃分23個(gè)OTUs，每個(gè)OTU中隨機(jī)選取一條序列為代表序列（GenBank號(hào)：MN904800-MN904822）;大葉千斤拔根系樣本含16個(gè)OTUs，細(xì)葉千斤拔根系樣本含12個(gè)OTUs。綜合每個(gè)物種的3個(gè)采樣點(diǎn)結(jié)果，大葉千斤拔的Shannon多樣性指數(shù)為1.80，細(xì)葉千斤拔則為1.13。以上結(jié)果表明大葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌種類(lèi)較為豐富，但與細(xì)葉千斤拔比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3?系統(tǒng)發(fā)育分析與叢枝菌根真菌群落組成?對(duì)已獲得23個(gè)序列類(lèi)型中的代表序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，見(jiàn)圖1，大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌種類(lèi)分屬于5個(gè)科，19個(gè)屬;經(jīng)Blast序列比對(duì)，僅6個(gè)可以鑒定到種（Bootstrap>85）。6個(gè)可鑒定到種的可操作分類(lèi)單元中見(jiàn)表5，有1個(gè)優(yōu)勢(shì)類(lèi)群（Rhizophagus fasciculatus），2個(gè)常見(jiàn)類(lèi)群（Acaulospora spinosa、Rhizophagus intraradices），1個(gè)偶見(jiàn)類(lèi)群（Glomus indicum），2個(gè)稀有類(lèi)群（Claroideoglomus lamellosum、Glomus viscosum）。

與MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，18個(gè)序列類(lèi)群均可以劃分為虛擬分子分類(lèi)種（相似度>97%，見(jiàn)表5），且無(wú)分屬于同一虛擬分子分類(lèi)種的現(xiàn)象。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以及與虛擬分類(lèi)分子種比對(duì)2種方法均未能對(duì)可操作分類(lèi)單元成功鑒定的有5個(gè)OTUs。通過(guò)虛擬分子種的劃分，將未能通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒定到種的4個(gè)OTUs、且在大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根內(nèi)為常見(jiàn)類(lèi)群的可操作分類(lèi)單元進(jìn)行虛擬分類(lèi)（OTU5、OTU6、OTU9、OTU12）。通過(guò)MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)還可以獲得對(duì)應(yīng)虛擬分子分類(lèi)種所處生態(tài)系統(tǒng)及生境的信息。在18個(gè)比對(duì)到虛擬分子分類(lèi)種的序列類(lèi)群中，6個(gè)序列類(lèi)群所對(duì)應(yīng)虛擬分子分類(lèi)種所處生境為熱帶生態(tài)系統(tǒng)，包含7.89%的克隆子;7個(gè)虛擬分子分類(lèi)種分布在亞熱帶生態(tài)系統(tǒng)，包含32.97%的克隆子;4個(gè)虛擬分子分類(lèi)種分布在亞熱帶生態(tài)系統(tǒng)，包含41.40%的克隆子。

2.4?大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌分布的差異?大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌分布相對(duì)多度見(jiàn)圖2所示。所獲得的23個(gè)序列類(lèi)型在大葉千斤拔和細(xì)葉千斤拔根內(nèi)的分布比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），在分布種類(lèi)和相對(duì)多度均有很大差別。在大葉千斤拔根內(nèi)16個(gè)序列類(lèi)型中，11個(gè)序列類(lèi)型僅在大葉千斤拔根系樣品中出現(xiàn)，相對(duì)多度最高的3個(gè)序列類(lèi)型依次為OTU22（9.06%）、OTU12（8.33%）、OTU4（7.61%）;在細(xì)葉千斤拔根內(nèi)12個(gè)序列類(lèi)型中，7個(gè)序列類(lèi)型僅在細(xì)葉千斤拔根系樣品中出現(xiàn)，相對(duì)多度最高的3個(gè)序列類(lèi)型依次為OTU3（15.25%）、OTU6（7.45%）、OTU11（2.48%）;OTU7（大葉千斤拔15.94%、細(xì)葉千斤拔48.23%）、OTU8（大葉千斤拔14.86%、細(xì)葉千斤拔1.06%）、OTU9（大葉千斤拔1.81%、細(xì)葉千斤拔18.09%）、OTU5（大葉千斤拔9.78%、細(xì)葉千斤拔3.90%）在2種樣品中均有出現(xiàn)。

本文所獲得的23個(gè)序列類(lèi)群分屬于5個(gè)科，Glomeraceae在大葉千斤拔和細(xì)葉千斤拔根內(nèi)的相對(duì)多度均大于90%，是二者根內(nèi)共有種類(lèi)，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。大葉千斤拔根內(nèi)特有種類(lèi)為Diversisporaceae，是偶見(jiàn)類(lèi)群;細(xì)葉千斤拔根內(nèi)特有種類(lèi)為Acaulosporaceae、Ambisporaceae、Claroideoglomeraceae，前者為常見(jiàn)類(lèi)群，后二者為稀有類(lèi)群。

3?討論

通過(guò)Nested-PCR、RFLP與克隆測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，使用叢枝菌根真菌特異性引物進(jìn)行兩次擴(kuò)增，盡可能全面地獲得根內(nèi)不可培養(yǎng)叢枝菌根真菌的群落組成情況，并從大葉千斤拔和細(xì)葉千斤拔根內(nèi)獲得23個(gè)OTUs，分屬于5個(gè)科，其中Glomeraceae在大葉千斤拔和細(xì)葉千斤拔根內(nèi)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。由于Glomeraceae科叢枝菌根真菌可通過(guò)在根內(nèi)產(chǎn)生泡囊結(jié)構(gòu)儲(chǔ)存脂類(lèi)物質(zhì)幫助菌絲生長(zhǎng)及再侵染[28]，因此Glomeraceae科的繁殖策略更適合在經(jīng)常被擾動(dòng)的生態(tài)系統(tǒng)中存活[29]。已有研究表明，寬葉千斤拔在接種Glomeraceae科Funneliformis mosseae和Glomus versiforme可顯著促進(jìn)植株生長(zhǎng)和藥用部位的產(chǎn)量[30]。23個(gè)序列類(lèi)型中6個(gè)序列類(lèi)型鑒定到種，其中5種叢枝菌根真菌也廣泛存在于我國(guó)其他藥用植物根際土壤中：A.spinosa在人參[31]、三七[32]、三角葉黃連[33]等9種藥用植物根圍土壤中獲得;C.lamellosum則在石菖蒲[34]、薄荷[34]、喜樹(shù)[35]、蒙古扁桃[36]等藥用植物根圍土壤中發(fā)現(xiàn);R.intraradices則在半夏[37]、糯米團(tuán)[34]、紫茉莉[38]、連香樹(shù)[39]等13種藥用植物根圍土壤中獲得;R.fasciculatus則在人參、五味子、地黃、盾葉薯蕷等21種藥用植物根圍土壤中獲得[40];G.viscosum則在薯蕷、狗脊、南方紅豆杉等5中藥用植物根圍土壤中獲得[41];而G.indicum則未在我國(guó)已報(bào)道、分離叢枝菌根真菌的171中藥用植物根圍土壤中獲得，但其在大葉千斤拔根內(nèi)的相對(duì)多度較高，在篩選大葉千斤拔促生菌株時(shí)應(yīng)給予重視。另外，接種R.intraradices在高溫脅迫下可促進(jìn)蒼術(shù)根莖生物量的積累并顯著影響根莖揮發(fā)油總量和揮發(fā)油主要成分[42]，且可顯著提高庫(kù)頁(yè)紅景天的凈光合速率、根莖生物量及成活率[43]。同時(shí)該菌株為大葉千斤拔和細(xì)葉千斤拔根內(nèi)的常見(jiàn)類(lèi)群，應(yīng)積極考察其對(duì)千斤拔屬植物的促生長(zhǎng)和有效成分積累的作用，并關(guān)注該屬其他菌株與千斤拔屬植物的互作情況。

不可純培養(yǎng)的叢枝菌根真菌的鑒定早期主要是從根際土壤分離孢子進(jìn)行形態(tài)學(xué)種類(lèi)劃分，導(dǎo)致產(chǎn)孢數(shù)量少或不產(chǎn)孢的種類(lèi)并沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多研究表明植物根系中分布的叢枝菌根真菌群落與土壤中分布的群落有很大差異[44]。由此，基于分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)根內(nèi)叢枝菌根真菌群落組成進(jìn)行考察，所獲的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群往往無(wú)法被鑒定到種的水平。利用MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)、基于18S rRNA基因序列將叢枝菌根真菌的序列類(lèi)型進(jìn)行虛擬分類(lèi)，可以更充分地挖掘分子鑒定的數(shù)據(jù)，使未能鑒定到種的序列類(lèi)型也能找到與之相對(duì)應(yīng)的虛擬分類(lèi)分子種，并發(fā)現(xiàn)其在全球范圍內(nèi)的分布特點(diǎn)和生態(tài)學(xué)功能。在所獲得的23個(gè)OTUs中，僅有6個(gè)OTUs可以比對(duì)到已獲得孢子的形態(tài)鑒定物種，剩下17個(gè)OTUs的分類(lèi)信息則無(wú)法確認(rèn)。但通過(guò)MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，又獲得13個(gè)OTUs對(duì)應(yīng)的虛擬分類(lèi)分子種，該數(shù)據(jù)庫(kù)還提供虛擬分類(lèi)分子種的各種相關(guān)信息，包括采樣點(diǎn)的生態(tài)系統(tǒng)類(lèi)型、植被類(lèi)型、相關(guān)已發(fā)表文獻(xiàn)等信息，可對(duì)分子種進(jìn)行后續(xù)研究、分析。因此，大葉千斤拔和細(xì)葉千斤拔根系樣品中的絕大多數(shù)真菌群落得以鑒定，并對(duì)其棲息環(huán)境的偏好性及其作用有了一定的了解。大葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌種類(lèi)更傾向于分布在人為擾動(dòng)較小的野生環(huán)境中，而細(xì)葉千斤拔根內(nèi)的叢枝菌根真菌則傾向于分布在受人類(lèi)活動(dòng)影響的生態(tài)系統(tǒng)中。分子種OTU6（VTX00093）分離自亞熱帶重金屬污染土壤，僅在細(xì)葉千斤拔根系中發(fā)現(xiàn)，表明該地土壤人為擾動(dòng)因素較多。所處生境會(huì)直接影響根內(nèi)叢枝菌根真菌群落組成，真菌種類(lèi)又會(huì)直接影響與植物的互作結(jié)果[45]。喜樹(shù)幼苗分別接種6種叢枝菌根真菌后[46]，發(fā)現(xiàn)均對(duì)喜樹(shù)堿的代謝有影響。與無(wú)菌根幼苗對(duì)比，除F.mosseae會(huì)引起喜樹(shù)堿含量降低外，其他5種叢枝菌根真菌種類(lèi)都顯著提高了喜樹(shù)堿的含量，且物種之間是存在顯著差異的，還有叢枝菌根真菌對(duì)喜樹(shù)幼苗喜樹(shù)堿含量的影響有器官差異。因此，在千斤拔屬植物種植時(shí)，應(yīng)根據(jù)與之互作的根內(nèi)菌落分布特征，選取具有相應(yīng)棲息偏好的種類(lèi)作為篩選促生菌株的候選。對(duì)根內(nèi)叢枝菌根真菌群落組成的鑒定，有助于全面地了解該植物所處生境，解讀更多利于植物生長(zhǎng)的微環(huán)境變化。

綜上所述，本研究基于18S rRNA分子鑒定技術(shù)及MaarjAM數(shù)據(jù)庫(kù)，全面地對(duì)大葉千斤拔與細(xì)葉千斤拔根內(nèi)叢枝菌根真菌組成進(jìn)行分析，結(jié)合叢枝菌根真菌在生態(tài)系統(tǒng)中的分布特點(diǎn)，有助于對(duì)這些缺乏形態(tài)學(xué)研究的叢枝菌根真菌種類(lèi)的相應(yīng)生態(tài)功能進(jìn)行總結(jié)分析，為種植大葉千斤拔的選址提供有力地環(huán)境指標(biāo)數(shù)據(jù)，并為篩選促生菌株提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].41卷.北京：科學(xué)出版社，1995：313.

[2]陳一，李開(kāi)雙，黃峰嬌.千斤拔的鎮(zhèn)痛和抗炎作用[J].廣西醫(yī)學(xué)，1993，15（2）：77-79.

[3]任朝琴，戴先芝，劉圓.千斤拔藥材資源開(kāi)發(fā)與利用的調(diào)查報(bào)告[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，37（4）：610-613.

[4]Cardillo G，Merlini L，Mondelli R.Natural chromenes-III：colouring matters of wars：the structure of flemingins A，B，C and homoflemingin[J].Tetrahedron，1968，24（1）：497-510.

[5]Cheng S Y，Xie Y，F(xiàn)eng X L，et al.Study of the volatile constituents in Radix Flemingia macrophyllae and a substitute by gas chromatography-mass spectrometry and chemometric methods[J].Molecules，2012，17（12）：14111-14125.

[6]Ko Y J，Lu T C，Kitanaka S，et al.Analgesic and anti-inflammatory activities of the aqueous extracts from three Flemingia species[J].Am J Chin Med，2010，38（3）：625-638.

[7]Wang Y，Curtis-Long M J，Yuk H J，et al.Bacterial neuraminidase inhibitory effects of prenylated isoflavones from roots of Flemingia philippinensis[J].Bioorg Med Chem，2013，21（21）：6398-6404.

[8]Ho H Y，Wu J B，Lin W C.Flemingia macrophylla extract ameliorates experimental osteoporosis in ovariectomized rats[J].Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，2009，2011（18）：752302.

[9]李昌松，張麗霞，趙俊凌，等.云南地區(qū)大葉千斤拔不同種質(zhì)的異黃酮含量比較[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011，13（10）：30-32，42.

[10]管志斌，張麗霞，高微微.大葉千斤拔種子萌發(fā)特性研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（13）：116-120.

[11]Jansa J，Smith F A，Smith S E.Are there benefits of simultaneous root colonization by different arbuscular mycorrhizal fungi？[J].New Phytologist，2008，177（3）：779-789.

[12]姜攀，王明元.廈門(mén)市七種藥用植物根圍AM真菌的侵染率和多樣性[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32（13）：4043-4051.

[13]郭巧生，程俐陶，劉作易.叢枝菌根真菌對(duì)半夏產(chǎn)量及化學(xué)成分的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（3）：333-338.

[14]周加海，范繼紅.AM真菌對(duì)川黃柏幼苗生長(zhǎng)及小檗堿含量的影響[J].北方園藝，2007，31（12）：25-27.

[15]滕華容.AM真菌與施磷量對(duì)柴胡生長(zhǎng)和化學(xué)成分交互效應(yīng)的研究[D].咸陽(yáng)：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.

[16]Hijri I，Zuzana Sykorová，Oehl F，et al.Communities of arbuscular mycorrhizal fungi in arable soils are not necessarily low in diversity[J].Molecular Ecology，2006，15（8）：2277-2289.

[17]趙婧，賀學(xué)禮.河北省安國(guó)市藥用植物AM真菌資源和分布研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（1），43-48.

[18]盧華正，沙麗清，王君，等.西雙版納熱帶季節(jié)雨林與橡膠林土壤呼吸的季節(jié)變化[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，20（10），2315-2322.

[19]Phillips JM，Hayman DS，1970.Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J].Transaction of the British Mycological Society，55（1）：158-161.

[20]周麗思，郭順星.云南西雙版納野生與栽培絞股藍(lán)根內(nèi)叢枝菌根真菌的分子多樣性[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，24（9）：2503-2510.

[21]Jakobsen I，Abbott LK，Robosen AD.External hyphae of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi associated with Trifolium subterraneum L[J].New Phytologist，1992，120（3）：371-380.

[22]Lee J，Lee S，Young JPW.Improved PCR primers for the detection and identification of arbuscular mycorrhizal fungi[J].FEMS Microbiology Ecology，2008，65（2）：339-349.

[23]Simon L，Lévesque RC，Lalonde M.Identification of endomycorrhizal fungi colonizing roots by fluorescent single-strand conformation polymorphism-polymerase chain reaction[J].Applied and Environmental Microbiology，1993，59（12）：4211-4215.

[24]Helgason T，Daniell TJ，Husband R，F(xiàn)itter AH，Young JP.Ploughing up the wood-wide web？[J].Nature，1998，394（6692）：431.

[25]pik M，Vanatoa A，Vanatoa E，et al.The online database MaarjAM reveals global and ecosystemic distribution patterns in arbuscular mycorrhizal fungi（Glomeromycota）[J].New Phytologist，2010，188（1）：223-241.

[26]Toljander JF，Santos-González JC，Tehler A，F(xiàn)inlay RD.Community analysis of arbuscular mycorrhizal fungi and bacteria in the maize mycorrhizosphere in a long-term fertilization trial[J].FEMS Microbiology Ecology，2008，65（2）：323-338.

[27]Heuer H，Smalla K.Evaluation of community-level catabolic profiling using BIOLOG GN microplates to study microbial community changes in potato phyllosphere[J].Journal of Microbiological Methods，1997，30（1）：49-61.

[28]Pietikinen A，Kytviita MM，Husband R.，Young JP.Diversity and persistence of arbuscular mycorrhizas in a low-arctic meadow habitat[J].New Phytologist，2007，176（3）：691-698.

[29]Brundrett M，Abbott LK，Jasper DA.Glomalean mycorrhizal fungi from tropical Australia.I.Comparison of the effectiveness and specificity of different isolation procedures[J].Mycorrhiza，1999，8（6）：305-314.

[30]譚鉅發(fā)，黃京華，扶蓉，等.接種AM真菌對(duì)四種藥用植物生長(zhǎng)的影響研究初報(bào)[J].中藥材，2009，32（6），15-17.

[31]李香串.接種泡囊-叢枝菌根劑對(duì)人參產(chǎn)量的影響[J].中藥材，2003，26（7）：475-476.

[31]任嘉紅，劉瑞祥，李云玲.三七叢枝菌根（AM）的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（2）：224-227.

[33]黃文麗，范昕建，嚴(yán)鑄云，等.三角葉黃連叢枝菌根真菌的多樣性研究[J].中草藥，2012，35（5）：689-693.

[34]姜攀，王明元，盧靜嬋.福建漳州常見(jiàn)藥用植物根圍的叢枝菌根真菌[J].菌物學(xué)報(bào)，2012，31（5）：676-689.

[35]于洋，于濤，王洋，等.接種后共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)叢枝菌根喜樹(shù)幼苗喜樹(shù)堿含量的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32（5）：1371-1377.

[36]王琚鋼.蒙古扁桃AMF多樣性及AM提高蒙古扁桃抗旱機(jī)制研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2011.

[37]程俐陶，郭巧生，劉作易.栽培及野生半夏叢枝菌根研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（4）：405-410.

[38]王虹，李鶯，趙麗莉.VA菌根真菌對(duì)紫茉莉生長(zhǎng)的影響[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，45（1）：22-23，41.

[39]王森，唐明，牛振川，等.山西歷山珍稀藥用植物AM真菌資源與土壤因子的關(guān)系[J].西北植物學(xué)報(bào)，2008，28（2）：0355-0361.

[40]米芳珍.商洛地區(qū)8種藥用植物VA菌根真菌的資源調(diào)查[J].山西林業(yè)科技，2012，41（5）：37-39.

[41]趙金莉，程學(xué)謙，顧曉陽(yáng)，等.河北安國(guó)新“八大祁藥”根際AM真菌與土壤因子的關(guān)系[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（6）：87-91.

[42]張霽，劉大會(huì)，郭蘭萍，等.不同溫度下叢枝菌根對(duì)蒼術(shù)根莖生物量和揮發(fā)油的影響[J].中草藥，2011，42（2）：372-375.

[43]李熙英，黃世臣.叢枝菌菌根對(duì)1年生高山紅景天植株生長(zhǎng)的影響[J].林業(yè)科技，2005，33（3）：25-27.

[44]pik M，Metsis M，Daniell TJ，Zobel M，Moora M.Large-scale parallel 454 sequencing reveals host ecological group speci-city of arbuscular mycorrhizal fungi in a boreonemoral forest[J].New Phytologist，2009，184（2）：424-437.

[45]Treseder KK，Cross A.Global distributions of arbuscular mycorrhizal fungi[J].Ecosystems，2006，9（2）：305-316.

[46]趙昕.叢枝菌根真菌對(duì)喜樹(shù)幼苗的接種效應(yīng)[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2006.

（2020-02-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）