陳天朝，李 沁，姚 超，耿夢(mèng)麗，常倩倩，于蘭蘭，馬彥江

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450008； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000； 3.河南醫(yī)藥技師學(xué)院制劑工程系，河南 開封 457000；4.河南省直第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000)

中藥炮制是根據(jù)中醫(yī)藥理論，依照辨證論治用藥的需要、藥物自身性質(zhì)和調(diào)劑、制劑的不同要求所采取的一項(xiàng)傳統(tǒng)制藥技術(shù)，是中藥內(nèi)部大分子和小分子受熱發(fā)生變化，分子間化學(xué)鍵發(fā)生斷裂后重新結(jié)合的過(guò)程[1]。中藥飲片經(jīng)過(guò)炮制后可加工制成丸劑，具有便于攜帶、服用方便、保質(zhì)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。丸劑的制作，從飲片到打粉再到制丸，存在著物性的變化。物性即物質(zhì)固有的物理和化學(xué)屬性，對(duì)所選取中藥飲片及炮制品，一般從“形”“色”“氣”“味”“質(zhì)”進(jìn)行評(píng)價(jià)，而這些評(píng)價(jià)指標(biāo)可以通過(guò)物料相關(guān)物性的相對(duì)密度、氧化值、吸水率、吸水膨脹度、pH值等測(cè)定進(jìn)行數(shù)字化度量，再通過(guò)對(duì)炮制過(guò)程中小分子成分含量的變化，優(yōu)選出符合中醫(yī)藥整體觀的、過(guò)程可控的中藥炮制方法。山藥來(lái)自薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositeThunb.的干燥根莖，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，位列上品，具有補(bǔ)脾胃、益肺腎的作用[2]。山藥的炮制有麩制和清炒制，有關(guān)麩炒的研究比較多。本實(shí)驗(yàn)側(cè)重于清炒炮制中的炒黃、炒焦研究[3-4]。清炒制的山藥具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫和抗衰老的作用[5]。山藥中所含的尿囊素是小分子化合物，是山藥的有效成分，可以促進(jìn)上皮組織修復(fù)，生肌，被用于胃及十二指腸潰瘍的治療。本實(shí)驗(yàn)著重研究炮制后山藥丸劑中尿囊素與丸劑物性間的相關(guān)性，通過(guò)對(duì)山藥不同炮制品丸劑物性參數(shù)(吸水率、膨脹度、氧化值、pH值)與有效成分間的相關(guān)性研究并建立回歸線性模型。

1 藥品、試劑與儀器

山藥(批號(hào)1710201)、山藥炒黃(批號(hào)1710201)、山藥炒焦(批號(hào)1710201)，均為河南中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司產(chǎn)品，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部王宏賢副主任藥師鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositeThunb.的干燥根莖。尿囊素，純度≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究所提供，批號(hào)111501-200202；甲醇(批號(hào)20170903)、無(wú)水乙醇(批號(hào)20170529)、乙醚(批號(hào)20170415)，均為分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司產(chǎn)品；甲醇，色譜純，Sigma試劑公司產(chǎn)品。元素型18120純水裝置，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UltiMate 3000高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；BSA224S-CW型電子天平，德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品；KQ5200B型機(jī)械超聲波清洗儀器，上海合金超聲設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 山藥丸劑制備

表1 山藥丸劑均勻設(shè)計(jì)表 n=3

表2 山藥丸劑最佳泛制工藝

表3 山藥丸劑質(zhì)量檢測(cè) n=3

2.2 山藥丸劑物性參數(shù)的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[8]方法。

2.2.1 吸水率測(cè)定

將漏斗放置于恒溫恒濕、盛有純化水的干燥器內(nèi)。將濾紙折疊后放入漏斗內(nèi)飽和3 min，取出后放置于干燥濾紙上并放置配重。靜置30 s后，精密稱取吸水飽和濾紙質(zhì)量，再放回內(nèi)漏斗內(nèi)。精密稱取1.00 g不同炮制品丸劑置于濾紙中(水完全浸沒(méi)不同炮制品丸劑，但水面低于濾紙上層邊緣)。靜置1 h后，過(guò)濾3 min，同法處理帶有丸劑的濾紙。每種不同炮制品丸劑平行測(cè)定3次，取平均值，計(jì)算吸水率。

2.2.2 膨脹度的測(cè)定

按照2015版《中國(guó)藥典》四部通則2101膨脹度的測(cè)定方法[9]。

2.2.3 相對(duì)密度的測(cè)定

稱取不同炮制品丸劑1.00 g并記錄其質(zhì)量m；取25 mL膨脹度測(cè)定管，量取一定體積輕質(zhì)液態(tài)石蠟并記錄其體積V1；將稱量質(zhì)量后的中藥飲片投入膨脹度測(cè)定管中，使不同炮制品丸劑完全浸沒(méi)于液態(tài)石蠟液面以下，靜置至無(wú)氣泡產(chǎn)生。記錄投入不同炮制品丸劑后輕質(zhì)液態(tài)石蠟體積V2。每種炮制品丸劑平行測(cè)定3次，取平均值作為其相對(duì)密度[10]。計(jì)算不同炮制品丸劑相對(duì)密度d。

2.2.4 pH值的測(cè)定

取純水100 mL，準(zhǔn)確稱取不同炮制品丸劑1.00 g，加入100 mL純化水中，室溫下浸泡1 h，過(guò)濾，取濾液，測(cè)pH值。每種炮制品丸劑平行測(cè)定3次，取平均值。

2.2.5 氧化值的測(cè)定

稱取山藥炮制品丸劑7.50 g，置于裝有300 mL純水的圓底燒瓶中，混合均勻后接入蒸餾裝置，精確收集前50 mL餾分。用移液管準(zhǔn)確移取20 mL餾分于滴定瓶?jī)?nèi)，加入硫酸水溶液5 mL和0.002 mol/L KMnO4溶液10 mL，振蕩均勻后室溫下反應(yīng)30 min；然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 g/L的KI水溶液5 mL，滴加Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)溶液由黃棕色或深黃色變成淺黃色時(shí)，加1 mL淀粉溶液為指示劑，繼續(xù)用0.02 mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至無(wú)色。記錄消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V3(mL)[11]。另以丸劑等質(zhì)量水代替樣品重復(fù)上述操作進(jìn)行空白試驗(yàn)，記錄消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V4(mL)。氧化值OX公式：

式中：C為Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/L)，m為丸劑質(zhì)量。

2.2.6 物性參數(shù)測(cè)定結(jié)果

測(cè)得不同炮制品山藥丸劑物性參數(shù)(吸水率、吸水膨脹度、相對(duì)密度、pH值、過(guò)氧化值)3次平均值，見表4。經(jīng)過(guò)不同程度的炮制，相對(duì)密度、pH值、過(guò)氧化值增大。

表4 山藥丸劑物性參數(shù)均值 n=3

2.3 尿囊素含量的測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq( 4.6 mm×250 mm，5 μm ),流動(dòng)相為甲醇-水(1∶99)，流速 0.5 mL /min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm，柱溫30 ℃[8]。尿囊素色譜圖如圖1。

A.尿囊素對(duì)照品；B.山藥生品丸劑；C.山藥炒黃丸劑；D. 山藥炒焦丸劑；1. 尿囊素

2.3.2 供試品溶液制備

取上述丸劑適量，粉碎，精密稱量1.00g，加體積分?jǐn)?shù)為200 mL/L的乙醇20 mL，超聲(200 W，40 KHz)提取60 min，濾過(guò)，加體積分?jǐn)?shù)為200 mL/L的乙醇定容于25 mL容量瓶中，震蕩10 min，3 000 r/min 離心20 min，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得[8]。

2.3.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取尿囊素對(duì)照品10.00 mg于25 mL量瓶中，加200 ml/L乙醇溶解定容至刻度，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取0.1，0.5，1，1.5，2，2.5，3，5，10 mL對(duì)照品溶液于10 mL量瓶，加200 mL/L的乙醇定容。依次進(jìn)樣10 μL，按2.3.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y= 9.874X+0.258，r2=0.998。結(jié)果表明，尿囊素在4～400 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

取山藥丸劑粉末，制備供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下的方法進(jìn)行精密度考察，結(jié)果峰面積平均值為9.08，RSD值為0.94%。結(jié)果表明，此方法精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取山藥丸劑粉末，按照2.3.1項(xiàng)下方法，在時(shí)間點(diǎn)0，2，4，8，12，24 h進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果平均峰面積為9.09， RSD值為0.98%。結(jié)果表明，此方法穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取山藥丸劑20.00 g，平行取6份，精密稱定，按2.3.1項(xiàng)下方法進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到的RSD值為1.41%。結(jié)果表明，此方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知尿囊素含量的山藥生品丸劑細(xì)粉0.5 g，精密稱定，平行操作6份，分別加入200 mg/L尿囊素對(duì)照品溶液5 mL，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算得出尿囊素的平均加樣回收率、RSD值，見表5。結(jié)果表明，此方法準(zhǔn)確性良好。

表5 尿囊素回收率考察 n=6

2.3.9 尿囊素含量測(cè)定結(jié)果

取丸劑粉末1.00 g，平行3份，精密稱定，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。通過(guò)與尿囊素對(duì)照品對(duì)比，山藥炒焦后丸劑中尿囊素所對(duì)應(yīng)的峰消失，且山藥炒黃、炒焦后共同出現(xiàn)了3號(hào)峰，炒焦后出現(xiàn)4號(hào)峰，清炒制后的山藥丸劑出現(xiàn)了新峰。山藥不同炮制品丸劑尿囊素含量測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 丸劑中尿囊素含量測(cè)定結(jié)果 n=3

2.4 山藥丸劑體外溶出含量測(cè)定及溶出模型構(gòu)建

2.4.1 溶出液含量測(cè)定

選擇槳法進(jìn)行丸劑體外溶出實(shí)驗(yàn)[12]，以脫氣后的純水900 mL作為溶出介質(zhì)，設(shè)定溶出儀轉(zhuǎn)速為100 r/min，調(diào)節(jié)溫度為(37±0.5) ℃。在投藥前先將溶出儀保溫30 min，精密稱量丸劑20.00 g投入溶出杯，投藥時(shí)打開溶出儀轉(zhuǎn)槳并開始計(jì)時(shí)；在投藥后2，5，10，20，30，60，120，240，480 min取樣25 mL，并補(bǔ)充同體積、同溫度溶出介質(zhì)。山藥丸劑各時(shí)間點(diǎn)累積溶出百分率結(jié)果見表7。溶出液處理后經(jīng)0.45 μm 濾頭過(guò)濾后，置于HPLC中進(jìn)樣，進(jìn)行含量測(cè)定。通過(guò)溶出百分率做出尿囊素溶出曲線圖，見圖2。結(jié)果表明，清炒炮制對(duì)山藥丸劑尿囊素的溶出速率有減緩作用。

表7 山藥丸劑尿囊素各時(shí)間點(diǎn)累積溶出百分率

圖2 山藥丸劑尿囊素溶出曲線圖

2.4.2 山藥丸劑尿囊素溶出模型擬合方程

利用威布爾分布(WeibuLL)建立模型F=1-exp(-(t-α)^γ/β)，F(xiàn)表示尿囊素溶出率百分比，γ為形狀參數(shù)即斜率。用Excel分析ln(ln(1/(1-F(t))))與ln(t-α)得到一元線性回歸方程[13]，通過(guò)對(duì)比R2得出威布爾模型優(yōu)于對(duì)數(shù)模型，故以威布爾模型作為山藥丸劑尿囊素溶出規(guī)律模型，結(jié)果見表8。

表8 山藥丸劑尿囊素溶出模型擬合方程

注：e為自然對(duì)數(shù)的底數(shù)，t代表溶出時(shí)間。

2.5 相關(guān)性分析

2.5.1 清炒法對(duì)丸劑物性參數(shù)相關(guān)性檢驗(yàn)

運(yùn)用SPSS 24.0對(duì)山藥丸劑指標(biāo)成分與物性參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析[14]，結(jié)果見表9。從表9中可知，山藥丸劑尿囊素與相對(duì)密度、pH值及氧化值間存在極強(qiáng)相關(guān)性。

表9 山藥丸劑尿囊素與物性參數(shù)之間相關(guān)性 n=9

注：*P<0.01。

2.5.2 尿囊素與氧化值及相對(duì)密度線性關(guān)系分析

運(yùn)用SPSS 24.0軟件，采用步進(jìn)法進(jìn)行線性回歸分析[15]，可知尿囊素與氧化值及相對(duì)密度呈線性回歸關(guān)系(P<0.01)，與pH值線性關(guān)系不明顯。線性回歸方程為Y=24.297 86+0.050 111X1-27.312 2X2(X1為氧化值，X2為相對(duì)密度)。因此，可以通過(guò)對(duì)氧化值與相對(duì)密度的測(cè)定來(lái)間接反映不同炮制品山藥丸劑尿囊素的含量，山藥丸劑尿囊素與氧化值及相對(duì)密度相關(guān)性分析見表10。

2.5.3 清炒制法與尿囊素含量間多重性分析

清炒制法與尿囊素含量間多重性分析得出，山藥炒黃、炒焦丸劑與山藥生品丸劑顯著性相關(guān)，置信水平95%，見表11。

表10 山藥丸劑尿囊素與氧化值及相對(duì)密度間的線性相關(guān)性分析

注：因變量為尿囊素。

表11 尿囊素含量與清炒法的多重性分析

注：因變量為尿囊素，*P<0.05。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)3種山藥炮制品丸劑物性參數(shù)的測(cè)定發(fā)現(xiàn)：隨著炮制程度的加大，丸劑的相對(duì)密度、pH值、氧化值增大，吸水率先減小后增大，吸水膨脹度先增大后減小。中藥飲片在炮制過(guò)程中由于溫度的持續(xù)上升快速地氧化。美拉德反應(yīng)證明：中藥飲片在高溫下，其成分中的氨基和羰基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生褐色成分同時(shí)伴隨pH值和過(guò)氧化值的變化；隨著炮制溫度的升高、炮制時(shí)間的增加，藥材的質(zhì)地變硬，導(dǎo)致吸水率減小；隨著炒制程度加深，藥材粉性增加，從而吸水率增加。另外，炮制也會(huì)對(duì)山藥飲片中的小分子成分產(chǎn)生影響。尿囊素作為山藥丸劑的指標(biāo)性成分，隨著炮制程度加深其含量減少，HPLC色譜中出現(xiàn)新的色譜峰，提示可能在此過(guò)程中產(chǎn)生了新的化學(xué)成分。本實(shí)驗(yàn)可以看出，炮制后的山藥丸劑物性參數(shù)與有效成分之間具有一定的相關(guān)性。從中醫(yī)藥的整體觀來(lái)看，物性和炮制工藝間有著一定的傳遞性，炮制會(huì)引起中藥丸劑物性參數(shù)及有效成分含量的變化，可以兩者之間的相關(guān)性為基礎(chǔ)，更加全面科學(xué)地對(duì)中藥炮制理論進(jìn)行研究。

本次實(shí)驗(yàn)得出山藥丸劑中尿囊素的溶出可以構(gòu)建一定的線性回歸模型，結(jié)合尿囊素與物性參數(shù)間的相關(guān)性，可以為中藥飲片制丸提供一定的數(shù)據(jù)參數(shù)指導(dǎo)， 可以克服一些傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別的弊端，比如通過(guò)色澤、外形等對(duì)中藥飲片進(jìn)行鑒別。中藥炮制需要現(xiàn)代化、智能化。探討山藥不同炮制品丸劑的有效成分和物性參數(shù)，以及物性參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián)性為中藥炮制的標(biāo)準(zhǔn)化和智能數(shù)字化奠定了一定的基礎(chǔ)。