王曉艷，李偉霞，張 輝，張書(shū)琦，宋少華，王 炎，唐進(jìn)法

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥臨床評(píng)價(jià)技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450008)

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)[1]，其性溫，味苦、辛，具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉的功效，為臨床常用補(bǔ)益類中藥，目前已開(kāi)發(fā)形成220種中成藥制劑。近年來(lái)，補(bǔ)骨脂相關(guān)制劑致肝損傷現(xiàn)象屢見(jiàn)報(bào)道[2-3]，國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心多次通報(bào)警示補(bǔ)骨脂相關(guān)制劑(壯骨關(guān)節(jié)丸和仙靈骨葆膠囊)臨床應(yīng)用致肝損傷，此外，還有單味補(bǔ)骨脂引發(fā)肝損害的臨床病例報(bào)道[4-5]，給臨床用藥帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。隨著對(duì)補(bǔ)骨脂的深入研究，已從中分離出香豆素類、黃酮類及單萜酚類三大類主要化合物成分近百種。研究發(fā)現(xiàn)，各類主要成分中均具有肝細(xì)胞毒性物質(zhì)[6-7]，但缺乏各類成分對(duì)肝細(xì)胞毒性作用差異的比較研究。本實(shí)驗(yàn)以人正常肝細(xì)胞系(L02肝細(xì)胞)為評(píng)價(jià)模型，對(duì)比研究補(bǔ)骨脂及其主要香豆素類成分(補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂定)、查爾酮類成分(補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素)和單帖酚類成分(補(bǔ)骨脂酚)對(duì)人正常肝細(xì)胞系L02的毒性差異，為闡明補(bǔ)骨脂致肝損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

人正常肝細(xì)胞系L02，由河南中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。常規(guī)培養(yǎng)在含有體積分?jǐn)?shù)100 mL/L胎牛血清、100 U/ mL青霉素和100 U/ mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)50 mL/L的CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在狀態(tài)良好的細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期進(jìn)行。

1.2 藥品、試劑與儀器

生補(bǔ)骨脂購(gòu)自亳州廣源堂中藥飲片有限公司，批號(hào)180601，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李學(xué)林主任藥師鑒定，確認(rèn)為豆科植物補(bǔ)骨脂的干燥成熟果實(shí)。補(bǔ)骨脂以體積分?jǐn)?shù)為950 mL/ L乙醇回流提取，浸泡0.5 h后，加10倍量溶劑，回流提取2次(分別為2 h、1.5 h)，紗布過(guò)濾收集濾液，合并2次乙醇提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后真空干燥，制得干膏，備用。補(bǔ)骨脂素(批號(hào)16062808)、異補(bǔ)骨脂素(批號(hào)16062807)、補(bǔ)骨脂甲素(批號(hào)16110701)、補(bǔ)骨脂乙素(批號(hào)17022701)、補(bǔ)骨脂定(批號(hào)16042601)和補(bǔ)骨脂酚(批號(hào)160331)，均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，HPLC純度均≥98%；磷酸緩沖液(PBS)，購(gòu)自博斯特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)PYGOO21；四唑鹽(MTT，批號(hào)911L051)、二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)1213C0330)和青鏈霉素混合液(批號(hào)20190320)，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(批號(hào)NYMI1035)、胰酶(批號(hào)J170003)和DMEM(批號(hào)AL209346)，均購(gòu)自HyClone公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20190312)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20190408)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20190407)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、-80 ℃超低溫冰箱、離心機(jī)，均為Thermo賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡，Motic麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板均為美國(guó)康寧公司產(chǎn)品；加樣槽，BIOFIL廣州潔特生物過(guò)濾股份有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時(shí)間確定

配制適量補(bǔ)骨脂母液(按生藥量換算，下同)，分別稀釋至2，1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03，0.015 g/L備用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5 g/L的胰酶消化，用完全培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，取10 μL置顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待12 h細(xì)胞貼壁后，吸棄96孔板中舊的培養(yǎng)液，對(duì)照組用含體積分?jǐn)?shù)1 mL/L DMSO的培養(yǎng)液，給藥組用含補(bǔ)骨脂提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2，1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03，0.015 g/L的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24，48，72 h。每孔加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，37 ℃孵育箱孵育4 h，細(xì)胞內(nèi)形成藍(lán)紫色結(jié)晶，吸棄孔內(nèi)含MTT的培養(yǎng)液，每孔分別加入100 μL的DMSO，輕微震搖5 min，使結(jié)晶完全溶解，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(波長(zhǎng)為570 nm)，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.3.2 細(xì)胞抑制率

取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚和補(bǔ)骨脂定樣品適量，每種成分以DMSO分別配制成6.25，12.5，25，50，100，150和200 mg/L藥液，對(duì)照組為含體積分?jǐn)?shù)1 mL/L的DMSO。調(diào)整細(xì)胞密度，接種在96孔培養(yǎng)板中，放置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為50 mL/L 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；吸棄各孔中培養(yǎng)液，分別加入各質(zhì)量分?jǐn)?shù)樣品培養(yǎng)液200 μL，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，放置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為50 mL/L的CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24，48，72 h；各孔均加入預(yù)先配制好的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄含MTT的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的DMSO，輕微震搖5 min，使結(jié)晶完全溶解；于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞抑制率，并計(jì)算IC50值。

1.3.3 AST、ALT活性及LDH釋放率

取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚和補(bǔ)骨脂定樣品適量，每種單體均以DMSO分別配制成25，50和100 mg/L藥液，對(duì)照組用體積分?jǐn)?shù)為1 mL/L的DMSO。以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，放置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為50 mL/L的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液，采用生化試劑盒檢測(cè)AST、ALT活性及LDH釋放率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的補(bǔ)骨脂對(duì)L02肝細(xì)胞的抑制作用

補(bǔ)骨脂醇提物藥液作用于L02肝細(xì)胞24 h，補(bǔ)骨脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)從15 mg/L以2倍速增至60 mg/L的過(guò)程中，其對(duì)L02肝細(xì)胞增殖的抑制作用并不明顯(P>0.05)，均低于10%；而補(bǔ)骨脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至125 mg/L時(shí)，抑制作用顯著增加(P<0.05)，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至2 g/L時(shí)，細(xì)胞抑制率高達(dá)60%左右。對(duì)比相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)補(bǔ)骨脂作用不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)24和48 h之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與72 h相比，個(gè)別質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)L02肝細(xì)胞的抑制率變化明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖1。因此本研究選擇24，48和72 h為給藥時(shí)間，進(jìn)一步考察補(bǔ)骨脂及其主要成分對(duì)L02肝細(xì)胞的毒性。

圖1 不同作用時(shí)間及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)補(bǔ)骨脂對(duì)L02肝細(xì)胞的抑制作用

2.2 補(bǔ)骨脂主要成分對(duì)L02肝細(xì)胞的抑制作用

分別給藥培養(yǎng)24，48和72 h后檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚及補(bǔ)骨脂定對(duì)L02肝細(xì)胞抑制率均較高(P<0.05)。24 h的IC50值排序?yàn)檠a(bǔ)骨脂定<補(bǔ)骨脂甲素<補(bǔ)骨脂酚<補(bǔ)骨脂乙素<補(bǔ)骨脂素<異補(bǔ)骨脂素。補(bǔ)骨脂定25 mg/L給藥時(shí)對(duì)肝細(xì)胞的抑制率已達(dá)到49%，50 mg/L時(shí)抑制率高達(dá)77%，但持續(xù)增加質(zhì)量分?jǐn)?shù)至200 mg/L其對(duì)肝細(xì)胞的抑制率保持不變；而補(bǔ)骨脂甲素50 mg/L時(shí)抑制率為67.29%，100 mg/L時(shí)抑制率高達(dá)81.95%，但持續(xù)增加質(zhì)量分?jǐn)?shù)至200 mg/L其對(duì)肝細(xì)胞的抑制率保持不變。結(jié)果顯示：質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 mg/L以下時(shí)，相同給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下比較，補(bǔ)骨脂定對(duì)L02肝細(xì)胞抑制率較其他成分大；50 mg/ L以上時(shí)，補(bǔ)骨脂甲素對(duì)L02肝細(xì)胞抑制率較其他成分大。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂主要成分補(bǔ)骨脂素(A)、異補(bǔ)骨脂素(B)、補(bǔ)骨脂甲素(C)、補(bǔ)骨脂乙素(D)、補(bǔ)骨脂酚(E)及補(bǔ)骨脂定(F)對(duì)L02肝細(xì)胞的抑制作用

2.3 補(bǔ)骨脂及其主要成分對(duì)AST、ALT活性及LDH釋放率的影響

因24，48，72 h補(bǔ)骨脂主要成分對(duì)L02肝細(xì)胞增殖抑制率差異不大，故選擇給藥培養(yǎng)24 h對(duì)補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚及補(bǔ)骨脂定對(duì)L02肝細(xì)胞的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 mg/ L給藥時(shí)，補(bǔ)骨脂定對(duì)LDH的影響(升高15%)大于其他5個(gè)成分，而對(duì)ALT和AST的變化影響則小于異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚及補(bǔ)骨脂乙素；給藥100 mg/ L時(shí)，補(bǔ)骨脂定對(duì)LDH的影響大于補(bǔ)骨脂甲素，但小于補(bǔ)骨脂乙素(升高42%)，而對(duì)ALT和AST無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討 論

補(bǔ)骨脂作為傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，臨床運(yùn)用廣泛，歷代醫(yī)家用于治療腎虛、冷瀉、遺精滑精、小便頻數(shù)、腰膝冷痛等，外用治療皮膚病、白癜風(fēng)等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)骨脂具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗抑郁、促進(jìn)骨生長(zhǎng)、神經(jīng)保護(hù)、雌激素樣等多種作用[8-9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，含補(bǔ)骨脂的常用中成藥多達(dá)30余種。近年來(lái)補(bǔ)骨脂及其制劑的肝毒性引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[10]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，大劑量補(bǔ)骨脂水提物[11]、鹽補(bǔ)骨脂生粉、補(bǔ)骨脂生粉[12]、補(bǔ)骨脂醇提物[13]均表現(xiàn)出肝毒性，但補(bǔ)骨脂誘發(fā)肝損傷的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及確切機(jī)制尚不明了。

L02肝細(xì)胞對(duì)外源化合物具有較強(qiáng)的代謝能力，且該細(xì)胞株成熟、穩(wěn)定，易于培養(yǎng)，被廣泛用于藥物的細(xì)胞毒性篩選[14]。MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)常用的簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確方法，其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。異丙醇、二甲亞礬、SDS等有機(jī)溶劑能溶解細(xì)胞中的甲臜，在570 nm處有較強(qiáng)吸收[15]，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

本實(shí)驗(yàn)采用能夠最接近模擬藥物誘發(fā)人正常肝細(xì)胞毒性作用的L02作為研究對(duì)象，根據(jù)補(bǔ)骨脂產(chǎn)生肝損傷作用的藥理特征，通過(guò)檢測(cè)補(bǔ)骨脂及其不同類成分對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響，以細(xì)胞抑制率作為檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞密度、藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、藥物作用時(shí)間等一系列影響因素的篩選，建立了補(bǔ)骨脂肝毒性的細(xì)胞檢測(cè)方法。此方法操作簡(jiǎn)單快捷，靈敏度較高，可作為評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂體外肝毒性的有效方法。通過(guò)對(duì)補(bǔ)骨脂及其主要成分的肝損傷評(píng)價(jià)，可初步認(rèn)為異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚和補(bǔ)骨脂定可能是補(bǔ)骨脂致肝細(xì)胞損傷的潛在成分。同等質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件比較，補(bǔ)骨脂定和補(bǔ)骨脂甲素對(duì)肝細(xì)胞抑制率高于補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚。對(duì)生化指標(biāo)的影響顯示：25 mg/L時(shí)，補(bǔ)骨脂定對(duì)LDH的影響大于其他5個(gè)成分；100 mg/ L時(shí)，補(bǔ)骨脂定對(duì)LDH的影響大于補(bǔ)骨脂甲素，但小于補(bǔ)骨脂乙素，但對(duì)ALT和AST無(wú)明顯影響。抑制率與生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果基本一致。

綜上所述，異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚和補(bǔ)骨脂定是補(bǔ)骨脂導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的潛在成分，且補(bǔ)骨脂甲素和補(bǔ)骨脂定毒性強(qiáng)于其他4個(gè)成分。本研究還存在一些局限性，采用肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)并不能完全模擬機(jī)體對(duì)藥物的吸收、分布、代謝及排泄等各過(guò)程，并且肝臟組織中還存在其他類似肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和枯否細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞；因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將基于以上結(jié)果，一方面研究補(bǔ)骨脂及其主要成分對(duì)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的影響及作用機(jī)制，另一方面對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究，為深入研究補(bǔ)骨脂致肝損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。