秦 超，戴 曦，楊小瓊，王榮麗，王 星，李國平,3

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應實驗室，四川 瀘州 646000；3.西南交通大學附屬醫(yī)院 四川省成都市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都 610000)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種氣道慢性炎癥性疾病，其由多種細胞和細胞成分參與，發(fā)病機制極其復雜。近年來相關研究[1-2]表明:哮喘發(fā)病與氧化應激相關，機體內(nèi)外環(huán)境的改變可導致氧化應激反應加劇，其對哮喘的病理生理過程有著重要的影響。在氧化應激反應中，活性氧(reactive oxygen and species, ROS)產(chǎn)生與抗氧化防御反應對抗的這一過程被認為與哮喘炎癥的嚴重程度有關聯(lián)。研究[3-4]顯示：在哮喘患者中免疫應答過度表達可引發(fā)免疫細胞產(chǎn)生大量的活性氧和氮物質(reactive oxygen and nitrogen species, RONS)，如羥基自由基、超氧化物、過氧化物、過氧亞硝酸鹽和一氧化氮，RONS可以破壞氣道上皮細胞的脂質和蛋白質，加重DNA的氧化損傷，進而導致哮喘病理生理過程趨于嚴重。目前臨床治療哮喘的主要方法是吸入皮質類固醇，但很大比例的哮喘患者無法從糖皮質激素治療中獲益，而約1/3的哮喘患者從白三烯抑制劑治療中獲益[5]。因此，哮喘的治療目前仍是有待研討的重要課題之一。和厚樸酚(honokiol, HNK)是從傳統(tǒng)中藥厚樸中提取純化的主要有效治療成分，現(xiàn)被證明具有抗氧化、抗炎、抗細菌和抗腫瘤藥理作用[6]。目前關于HNK對哮喘治療作用的研究還鮮有報道。本研究通過制備小鼠哮喘模型，探討HNK對哮喘氧化應激及DNA損傷的抑制作用，從而探索治療哮喘的潛在新藥。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器C57BL/6J健康雌性小鼠20只，購自重慶騰鑫生物有限公司，6～8周齡，體質量18～22 g，動物合格證號：SCXK(京)2016-0002，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學動物實驗中心SPF級動物房，自由進食及飲水。雞卵清蛋白(ovalbumin，OVA)購自美國Sigma公司，氫氧化鋁[Al(OH)3]購自成都市科龍化工試劑廠，HNK購自西安開來生物工程有限公司(批號：K188171)，地塞米松(dexamethasone，DXM)購自上海通用藥業(yè)股份有限公司(規(guī)格1 mL∶5 mg，產(chǎn)品批號：1801233)，小鼠白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)檢測試劑盒購自安迪華泰(中國)生物科技有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)和H2AX組蛋白(γH2Ax)抗體購自美國CST公司。激光共聚焦熒光顯微鏡(德國Leica公司)，Allegra X-22R低溫離心機(美國Beckman Coulter公司)，電子天平(德國Startorious公司)，細胞計數(shù)板(美國Costar公司)，化學發(fā)光成像系統(tǒng)(DM4000 B)(美國Bio-Rad公司)，脫色搖床(北京六一儀器廠)，低溫恒溫水浴槽(上海恒平科學儀器有限公司)。

1.2 實驗動物分組、造模和給藥將20只C57BL健康雌性小鼠隨機分為對照組、模型組、DXM組和HNK組，每組5只。根據(jù)KIANMEHER等[7]的方法造模，模型組、DXM組和HNK組小鼠在實驗第1、7和14天分別經(jīng)腹腔注射OVA+Al(OH)3混懸液致敏；從第15天開始，OVA組、DXM組和HNK組小鼠在麻醉后經(jīng)鼻滴入激發(fā)液OVA，連續(xù)激發(fā)7 d，同時DXM組和HNK組小鼠在每次激發(fā)前30 min分別腹腔注射DXM溶液2 mg·kg-1及HNK溶液150 mg·kg-1，而對照組小鼠給予等量生理鹽水。

1.3 各組小鼠肺組織病理學觀察分離小鼠左肺組織，迅速放入4%多聚甲醛中固定，依次脫水、石蠟包埋、行HE染色，顯微鏡下觀察小鼠肺組織炎癥改變。

1.4 各組小鼠血清中IL-4、IL-6和IL-17水平檢測于末次激發(fā)后24 h內(nèi)麻醉小鼠，眼球采血，于4℃、以3 000 r·min-1離心15 min，收集血清，ELISA法檢測小鼠血清中IL-4、IL-6和IL-17水平。

1.5 各組小鼠肺泡灌洗液細胞計數(shù)處死全部小鼠，結扎左肺，取1.5 mL PBS溶液行右肺泡灌洗并回收，回收率為85%以上，于4℃、1 000 r·min-1離心10 min，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，收集上清，沉淀細胞以1 mL PBS緩沖液重懸，行細胞總數(shù)計數(shù)，并涂片行快速迪夫染色后于光鏡下行中性粒細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)。

1.6 各組小鼠肺組織勻漿中MDA水平和SOD及GSH-Px活性檢測取少量右肺組織生理鹽水中輕柔漂洗，濾紙吸干組織表面水分，電子秤上精確秤質量，加入9倍體積于肺組織的勻漿介質，置于冰面上手工勻漿，嚴格按照操作說明檢測肺組織勻漿中MDA水平和SOD及GSH-Px活性。

1.7 Western blotting法檢測各組小鼠肺組織中p-JNK、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2和γH2Ax蛋白表達水平取右肺組織，加入適量液氮研磨成粉末狀，加入1 mL裂解液冰上裂解30 min，于4℃、11 000 r·min-1離心10 min，BCA法測定樣品蛋白濃度，確定上樣量，依次電泳、轉膜、封閉和抗體孵育，化學發(fā)光法檢測，以蛋白條帶的灰度值表示肺組織中p-JNK、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2和γH2Ax蛋白表達水平。

1.8 各組小鼠肺組織中γH2Ax免疫熒光強度檢測取出提前制備的肺組織冰凍切片，室溫下放置，5% BSA溶液封閉10 min，加入約50 μL稀釋的一抗覆蓋，4℃過夜；PBS洗3次，加入50 μL相應熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，加入50 μL DAPI染液，室溫避光孵育5 min，PBS洗滌3次，封片，熒光顯微鏡下觀察顯像情況。

2 結 果

2.1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組小鼠肺組織無明顯炎癥改變；模型組小鼠可見支氣管管壁、平滑肌層增厚，部分氣道上皮細胞壞死脫落、支氣管管腔狹窄，氣道和血管周圍可見大量的炎癥細胞浸潤；與模型組比較，DXM組和HNK組小鼠上述病理形態(tài)改變較輕，而HNK組小鼠上述病理形態(tài)表現(xiàn)與DXM組相似。見圖1(插頁一)。

2.2 各組小鼠BALF中炎性細胞總數(shù)與對照組比較，模型組、DXM組和HNK組小鼠BALF中炎性細胞總數(shù)、中性粒細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞總數(shù)明顯增多(P<0.05)；與模型組比較，DXM組和HNK組小鼠BALF中炎性細胞總數(shù)、中性粒細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞總數(shù)減少(P<0.05)；HNK組小鼠BALF中炎性細胞浸潤程度高于DXM組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠BALF中炎性細胞總數(shù)和分類計數(shù)

GroupTotal number of inflammatory cells(×104 mL-1)Total number of neutrophils(×103 mL-1)Total number of eosinophils (×103 mL-1)Control9.69±2.400.25±0.070.68±0.23Model84.27±8.60?8.24±1.28?22.10±3.36?DXM38.08±4.39?△1.73±0.35?△6.94±0.89?△HNK44.75±5.59?△2.41±0.57?△8.03±0.79?△F87.0176.6770.22P<0.01<0.01<0.01

*P<0.05vscontrol group;△P< 0.05vsmodel group.

2.3 各組小鼠血清中IL-4、IL-6和IL-17水平與對照組比較，模型組、DXM組和HNK組小鼠血清中IL-4、IL-6和IL-17水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，DXM組和HNK組小鼠血清中IL-4、IL-6和IL-17水平降低(P<0.05);而HNK組小鼠血清中IL-4、IL-6和IL-17水平高于DXM組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 各組小鼠肺組織勻漿中MDA水平和SOD及GSH-Px活性與對照組比較，模型組、DXM組和HNK組小鼠肺組織勻漿中MDA水平明顯升高(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，DXM組和HNK組小鼠肺組織勻漿中MDA水平降低(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)；HNK組小鼠MDA水平高于DXM組，SOD和GSH-Px活性低于DXM組，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組小鼠血清中IL-4、IL-6和IL-17水平

GroupIL-4IL-6IL-17Control9.16±0.664.87±0.918.22±1.15Model47.69±4.52?32.62±2.49?44.92±2.88?DXM19.31±1.03?△16.24±2.78?△17.62±3.34?△HNK28.08±2.41?△26.52±2.26?△23.40±2.97?△F113.8678.8699.26P<0.01<0.01<0.01

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

表3 各組小鼠肺組織勻漿中MDA水平和SOD及GSH-Px活性

GroupMDA[cB/(mmol·L-1)]SOD[λB/(U·mL-1)]GSH-Px[λB/(U·mL-1)]Control6.38±0.58171.81±9.711 499.00±79.36Model17.30±1.81?77.85±10.48?890.69±57.54?DXM11.07±0.97?△132.62±12.30?△1 284.26±35.51?△HNK9.66±0.58?△94.90±12.09?△1 107.98±144.35?△F51.2236.4616.716P<0.01<0.01<0.01

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

2.5 各組小鼠肺組織中p-JNK、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2和γH2Ax蛋白表達水平與對照組比較，模型組、DXM組和HNK組小鼠肺組織中p-JNK、NF-κB、Caspase-3和γH2Ax蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，模型組小鼠肺組織中Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，DXM組和HNK組小鼠肺組織中p-JNK、NF-κB、Caspase-3和γH2Ax蛋白表達水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平升高(P<0.05)；HNK組小鼠肺組織中p-JNK、NF-κB、Caspase-3和γH2Ax蛋白表達水平高于DXM組，Bcl-2蛋白表達水平低于DXM組，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2和表4。

2.6 各組小鼠肺組織中γH2Ax免疫熒光強度與對照組比較，模型組、DXM組和HNK組小鼠肺組織中γH2Ax熒光強度明顯增強；與模型組比較，DXM組和HNK組小鼠肺組織中γH2Ax熒光強度有所減弱，而HNK組小鼠肺組織中γH2Ax免疫熒光強度與DXM組相似。見圖3(插頁一)。

3 討 論

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，能夠引起氣道高反應性、可逆性氣流受限、黏液高分泌和氣道重塑[8]。哮喘發(fā)病機制復雜，其中Th1/Th2型細胞失衡是重要因素之一[9]。哮喘可加速Th2細胞活化，促進IL-4的產(chǎn)生，進而誘導B淋巴細胞活化分泌特異性IgE，后者可促進肥大細胞增殖分化，進一步刺激相關炎癥細胞因子分泌，從而加重哮喘癥狀[10]。同時，單核細胞-巨噬細胞分泌的IL-6也可以促進Th2分化產(chǎn)生IL-4，進而加速哮喘的病理發(fā)展過程[11]，而CD4+Th亞群中的Th17/Treg失衡是導致哮喘加重的另外因素之一。Th17活化分泌炎性因子IL-17，IL-17可促進支氣管上皮纖維母細胞和平滑肌細胞增生，同時對中性粒細胞聚集浸潤也發(fā)揮了重要作用[12-13]，上述炎癥因子的增多均可進一步加重哮喘癥狀。

Lane 1:Control group;Lane 2:Model group;Lane 3:DXM group;Lane 4:HNK group.

圖2 各組小鼠肺組織中p-JNK、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2和γH2Ax蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of p-JNK,NF-κB,Caspase-3,Bcl-2 and γH2Ax proteins in lung tissue of mice in various groups

表4 各組小鼠肺組織中p-JNK、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2和γH2Ax蛋白表達水平

Groupp-JNKNF-κBCaspase-3Bcl-2γH2AxControl0.39±0.040.10±0.080.03±0.010.13±0.020.06±0.02Model1.25±0.06?0.62±0.06?0.46±0.05?0.07±0.02?0.46±0.10?DXM0.80±0.02?△0.31±0.04?△0.14±0.04?△0.42±0.04?△0.22±0.01?△HNK0.87±0.02?△0.36±0.04?△0.19±0.07?△0.39±0.03?△0.27±0.02?△F204.3043.5443.13117.2031.07P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

研究[14]表明：哮喘小鼠氣道中存在氧化應激水平升高以及DNA損傷現(xiàn)象。氧化應激反應可致抗氧化防御機制的失衡、ROS的大量產(chǎn)生，其中MDA作為脂質過氧化的最后產(chǎn)物，同時也是氧化應激的標志物，而GSH-Px和SOD則是保護細胞免受ROS損傷的重要抗氧化防御成分，其能清除體內(nèi)的氧自由基，有效地防止ROS對機體細胞的損害[15]。此外，大量產(chǎn)生的ROS還可導致中性粒細胞浸潤及多種形式的DNA損傷[16]，激活MAPK和NF-κB信號通路，從而進一步誘導細胞凋亡[17-18]。MAPK信號通路可誘導哮喘中許多炎性介質的生成，其中p-JNK是介導細胞凋亡的重要調節(jié)靶點，其可被多種細胞因子和氧化損傷等激活[19-21]。同時，DNA損傷是細胞凋亡的啟動因素也是必然結果，γH2Ax是反映DNA損傷程度和修復的生物標志物，其與細胞凋亡密切相關[22]。影響細胞凋亡的因素眾多，Caspase-3蛋白酶作為細胞凋亡最為關鍵的因子之一，不僅可以反映細胞凋亡的程度，還可以參與細胞凋亡的過程，而Bcl-2家族則為調控細胞凋亡的家族，可阻斷細胞凋亡的信號通路，從而抑制細胞凋亡的過程[23-24]。因此，通過藥物干預哮喘可在一定程度上減輕氣道上皮細胞凋亡及DNA損傷，從而控制哮喘病情。

HNK是從我國傳統(tǒng)中藥厚樸的干燥樹皮或根皮中提取的一種天然多酚類化合物，現(xiàn)代藥學研究[25]發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、抗血管生成和抗腫瘤等藥理作用。本研究結果顯示：通過使用HNK干預哮喘小鼠可使小鼠壞死脫落的氣道上皮細胞減少，在一定程度上減輕氣道壁、氣道平滑肌層增厚及管腔狹窄程度，還可減輕氣道旁的炎性細胞浸潤，表明HNK在治療哮喘上有一定作用。同時，HNK組小鼠血清中炎性因子IL-4、IL-6和IL-17水平較模型組降低，提示HNK可適當減輕哮喘肺組織炎癥反應。HNK組小鼠肺組織中MDA水平降低，而SOD和GSH-Px活性升高，說明HNK可以減輕氧化應激反應。進一步的研究結果顯示：與模型組比較，HNK組小鼠肺組織中p-JNK、NF-κB、Caspase-3和γH2Ax蛋白表達水平降低，而Bcl-2蛋白表達水平升高，這表明HNK可能是通過抑制JNK和NF-κB介導的信號通路的信息轉導，從而發(fā)揮減輕氧化應激反應、DNA損傷及減少氣道上皮細胞凋亡的作用。

綜上所述，HNK對哮喘小鼠肺組織炎癥反應有一定的干預作用，其機制可能是通過抑制氧化應激反應及DNA損傷這一過程來實現(xiàn)的。本研究為HNK在哮喘臨床治療應用上提供了實驗依據(jù),但該研究尚有不足之處，目前僅停留在動物實驗階段，且樣本量較少，其具體的作用機制有待進一步探討。