陳州華，龔 輝，馮 磊，肖玉潔，黃立中

(1.湖南省湘潭市第二人民醫(yī)院腫瘤科，湖南 湘潭 411100；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，湖南 長(zhǎng)沙 410006；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院內(nèi)科教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

乳腺癌位居女性惡性腫瘤發(fā)病的首位，2014年我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率為41.82/10萬(wàn)，位居女性惡性腫瘤死亡的第5位，死亡率為9.90/10萬(wàn)[1]。盡管目前認(rèn)為乳腺癌是一種可以控制的疾病，但每年約有52.2人萬(wàn)死于乳腺癌，主要是出現(xiàn)了復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。因此，闡明促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，采取針對(duì)性的治療，具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。研究[2]表明：乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)密切相關(guān)。EMT過(guò)程中，細(xì)胞失去極性、與周圍基質(zhì)和細(xì)胞的接觸減少，細(xì)胞的遷移及運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞表型發(fā)生改變，出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的特性，使腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)不僅是重要的炎性細(xì)胞因子，LPS誘導(dǎo)可增加前列腺癌細(xì)胞[3]、乳腺癌MCF-7細(xì)胞[4]、結(jié)腸癌細(xì)胞[5]、肝細(xì)胞癌細(xì)胞[6]遷移和侵襲，又是影響EMT的關(guān)鍵調(diào)控分子，可以誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[7]。三陰性乳腺癌占所有乳腺癌病理類型的15%左右，具有特殊的生物性行為和臨床病理特征，其侵襲性高，預(yù)后差。本研究探討LPS對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，觀察誘導(dǎo)EMT后細(xì)胞的形態(tài)及EMT標(biāo)志物及β-catenin表達(dá)情況，為進(jìn)一步控制三陰性乳腺癌的侵襲性生長(zhǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞(ER-、PR-、Her2-)來(lái)源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。LPS、PBS和青-鏈霉素(雙抗)購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DMSO購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，Alexa Fluor 488購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，Transwell insert購(gòu)自美國(guó)Costar公司，CCK-8購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-catenin和β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ImmunoWay公司，5×SDS-PAGE Loading Buffer和羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Vazyme公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，RIPA蛋白裂解液和超敏化學(xué)放光顯色試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司，DAPI和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Wellbio公司，彩色預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Amersham公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，無(wú)水乙醇購(gòu)自長(zhǎng)沙華康消毒劑有限公司，多聚甲醛購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，氯仿購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司，異丙醇購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司，引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)儀、Chemi DOC XRS 凝膠成像系統(tǒng)、iMark 酶標(biāo)儀和Smart Spec Plus 核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，低溫低速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，GG112-10B恒溫水浴箱購(gòu)自上海醫(yī)療器械廠，ADX-35B高壓蒸汽消毒器購(gòu)自上海申安器械廠，三氣培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶和細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Crystalgen公司，電泳儀、垂直板電泳槽、水平搖床和水平電轉(zhuǎn)槽購(gòu)自北京六一儀器廠，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海Spectrum公司，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和-80℃超低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，精密分析天平購(gòu)自瑞士Mettler公司，醫(yī)用凈化工作臺(tái)購(gòu)自江蘇省吳江凈化設(shè)備總廠，超微量分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Implen公司，微量移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，無(wú)RNA酶EP管、無(wú)RNA酶Tip頭和PCR管購(gòu)自美國(guó)Axgene公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)在5%CO2、37℃培養(yǎng)條件下，采用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，2 d換液1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為每孔5×105個(gè)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%融合時(shí)，分為5組：0 mg·L-1LPS組(對(duì)照組)、5 mg·L-1LPS組、10 mg·L-1LPS組、20 mg·L-1LPS組和40 mg·L-1LPS組，繼續(xù)培養(yǎng)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 LPS的配制取10 mg LPS加10 mL PBS緩沖液溶解，以0.22 μm微孔過(guò)濾膜除菌，分裝于15 mL離心管中4℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成5、10、20和40 mg·L-1。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察不同濃度(0、5、10、20和40 mg·L-1)LPS處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。

1.5 免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)將22 mm玻片放入6孔培養(yǎng)板中，單細(xì)胞懸液滴到玻片上，將6孔板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，細(xì)胞貼壁后，按分組加入2 mL不同濃度的LPS，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出爬片，PBS緩沖液清洗2～3次；將爬片用4%多聚甲醛固定30 min；PBS緩沖液沖洗5 min×3次；0.3% Triton X-100通透37℃、30 min；PBS緩沖液沖洗5 min×3次；5% BSA 37℃封閉1 h；孵育一抗：滴加適當(dāng)稀釋的一抗(β-catenin)，4℃過(guò)夜，PBS緩沖液沖洗5 min×3次；孵育二抗：滴加100～200 μL抗兔-IgG標(biāo)記熒光抗體，37℃孵育90 min，PBS緩沖液沖洗5 min×3次；DAPI染核：DAPI工作液37℃孵育10 min，PBS緩沖液沖洗5 min×3次；90%甘油封片。避光保存，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 RT-qPCR法檢測(cè)E-cadherin、Vimentin和β-catenin mRNA表達(dá)水平取各組MDA-MB-231細(xì)胞采用RNAiso Plus提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和β-catenin mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，E-cadherin 和Vimentin PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，循環(huán)40次，70℃延伸10 min。β-catenin PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，58℃退火30 s，70℃延伸30 s，循環(huán)40次，70℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物5 μL于2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。以目的基因與β-actin基因灰度值比值表示mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)：在NCBI上搜索目的基因的序列，采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋白表達(dá)水平細(xì)胞用PBS緩沖液洗3次，應(yīng)用細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，4℃振蕩，15 000 r·min-1離心20 min，提取細(xì)胞總蛋白，吸取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明書操作，測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白加入緩沖液，煮沸變性。清洗玻璃板，晾干，固定在制膠槽上，點(diǎn)樣(8%SDS-PAGE分離膠和4%濃縮膠)。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBS配制5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗E-cadherin(1∶500)、Vimentin(1∶1 000)、β-catenin(1∶5 000)和β-actin(1∶1 000)4℃冰箱孵育過(guò)夜，次日TBST漂洗10 min×3次。加入1∶2 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST漂洗10 min×3次。使用ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育3 min，顯色。凝膠成像分析儀采集圖像，以β-actin為內(nèi)參，測(cè)定目的蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)為圓形、橢圓形，細(xì)胞表現(xiàn)為上皮細(xì)胞表型，呈鵝卵石樣；LPS作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞拉長(zhǎng)、間隙變寬，表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞表型，呈紡錘體形，且隨著LPS濃度的增加，細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞形態(tài)由紡錘體形逐漸伸出觸角。見(jiàn)圖1。

2.2 各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中β-catenin表達(dá)及定位與對(duì)照組比較，5、10、20和40 mg·L-1LPS組MDA-MB-231細(xì)胞中β-catenin表達(dá)增加；與5和10 mg·L-1LPS組比較，20 mg·L-1LPS組MDA-MB-231細(xì)胞中β-catenin表達(dá)增加；與20 mg·L-1LPS組比較，40 mg·L-1LPS組MDA-MB-231細(xì)胞中β-catenin表達(dá)降低。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果提示β-catenin的表達(dá)主要在細(xì)胞核。見(jiàn)圖2(插頁(yè)四)。

A:Control group;B:5 mg·L-1 LPS group;C:10 mg·L-1 LPS group;D:20 mg·L-1 LPS group;E:40 mg·L-1 LPS group.

2.3 各組乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和β-catenin mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，不同濃度LPS組MDA-MB-231細(xì)胞中Vimentin和β-catenin mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05或P<0.01)，E-cadherin mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01)，并且隨著LPS濃度的升高呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，20 mg·L-1LPS組最明顯。見(jiàn)圖3。

2.4 各組 MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，不同濃度LPS組MDA-MB-231細(xì)胞中Vimentin和β-catenin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05或P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01)，并且隨著LPS濃度的升高呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，20 mg·L-1LPS組最明顯。見(jiàn)圖4和圖5。

n=3.*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.05 compared with 5 mg·L-1LPS group;#P<0.05 compared with 10 mg·L-1LPS group;○P<0.05 compared with 20 mg·L-1LPS group.

圖3 各組MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和β-catenin mRNA 表達(dá)水平

Fig.3 Expression levels of E-cadherin, Vimentin and β-catenin mRNA in MDA-MB-231 cells in various groups

n=3.*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.05 compared with 5 mg·L-1LPS group;#P<0.05 compared with 10 mg·L-1LPS group;○P<0.05 compared with 20 mg·L-1LPS group.

圖4 各組MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和β-catenin 蛋白表達(dá)水平

Fig.4 Expression levels of E-cadherin, Vimentin and β-catenin proteins in MDA-MB-231 cells in various groups

Lane 1: Control group; Lane 2: 5 mg·L-1LPS group; Lane 3: 10 mg·L-1LPS group; Lane 4: 20 mg·L-1LPS group; Lane 5: 40 mg·L-1LPS group.

圖5 Western blotting法檢測(cè)各組MDA-MB-231細(xì)胞中蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of proteins in MDA-MB-231 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

乳腺癌的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移與EMT有密切關(guān)系，EMT是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，上皮源性惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，被稱為腫瘤中“沉睡的胚胎發(fā)育程序”，一旦該沉睡的程序被喚醒，便意味著腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的開始。主要表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，上皮細(xì)胞的極性喪失，細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)破壞，由鵝卵石樣上皮細(xì)胞表型向紡錘樣間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。EMT過(guò)程中，細(xì)胞失去極性、與周圍基質(zhì)和細(xì)胞的接觸減少，細(xì)胞的遷移及運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞表型發(fā)生改變，出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的特性。以往實(shí)驗(yàn)[8]證明：維持細(xì)胞連接穩(wěn)定需要E-cadherin的存在，抗E-cadherin抗體可破壞細(xì)胞間連接，并可誘發(fā)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化；Vimentin在EMT發(fā)生后表達(dá)增多，且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移的作用。

LPS是組成革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分之一，具有廣泛的生物學(xué)活性[9]，研究[7, 10-11]發(fā)現(xiàn)：LPS不僅是重要的炎性細(xì)胞因子，又是影響EMT的關(guān)鍵調(diào)控分子，可以誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，LPS刺激乳腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲或轉(zhuǎn)移。

LPS能促進(jìn)胃癌細(xì)胞[12]和膀胱癌細(xì)胞[13]的增殖，能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞[14]和前列腺癌細(xì)胞[3]的增殖、遷移和侵襲，可增加乳腺癌MCF-7細(xì)胞[4]、結(jié)腸癌細(xì)胞[5]和肝細(xì)胞癌細(xì)胞[6]遷移、侵襲，可誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231[8]和MCF-7[15]細(xì)胞發(fā)生EMT。KIM等[16]研究顯示：LPS通過(guò)獲得間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(Vimentin和N-cadherin)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadherin)，誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞EMT。ZHANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)：LPS可誘導(dǎo)小鼠肺組織EMT，促進(jìn)纖維化。HE等[18]研究發(fā)現(xiàn)：LPS可誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和EMT，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。也正是考慮到LPS在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的EMT分子機(jī)制中所發(fā)揮的重要角色[19]，LPS作為各種上皮細(xì)胞的EMT誘導(dǎo)因子而廣泛應(yīng)用于上皮細(xì)胞間質(zhì)化的研究過(guò)程中[20]。EMT的進(jìn)程在乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，近年來(lái)，許多研究集中在EMT的誘導(dǎo)機(jī)制，研究者[21]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin與調(diào)控EMT過(guò)程中的分子調(diào)節(jié)有關(guān)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活的關(guān)鍵是β-catenin降解障礙，從而使胞漿內(nèi)游離的β-catenin聚集，當(dāng)積聚到一定濃度時(shí)開始向胞核轉(zhuǎn)移，與LEF/TCF結(jié)合進(jìn)入胞內(nèi)，激活下游的靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展[22]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的失調(diào)與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[23]，在乳腺癌中β-catenin可發(fā)生突變、聚集，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

研究[24]顯示：乳腺癌EMT與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，在浸潤(rùn)性乳腺導(dǎo)管癌的EMT中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)[25]發(fā)現(xiàn)：β-catenin的敲低導(dǎo)致上皮E-cadherin表達(dá)的減少，MDA-MB-231細(xì)胞中細(xì)胞遷移率和Vimentin蛋白表達(dá)的升高。國(guó)內(nèi)研究[26]顯示：下調(diào)β-catenin組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)和遷移距離明顯少于MDA-MB-231組和對(duì)照組。通過(guò)下調(diào)β-catenin阻止Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，可降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞間質(zhì)表型的表達(dá)，促進(jìn)上皮表型的表達(dá)，從而降低細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力。

本研究結(jié)果顯示：LPS作用后三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞出現(xiàn)典型的EMT形態(tài)改變，細(xì)胞拉長(zhǎng)、間隙變寬，表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞表型，呈紡錘體形，且隨著LPS濃度的升高，細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞形態(tài)由紡錘體形逐漸伸出觸角。有實(shí)驗(yàn)[27]證明LPS能刺激小鼠黑色素瘤細(xì)胞系(B16F10)增殖，呈時(shí)間和劑量的依賴性，5 mg·L-1LPS作用24 h后活性較強(qiáng)。本研究免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：β-catenin的表達(dá)主要在細(xì)胞核，且20 mg·L-1LPS組β-catenin表達(dá)最明顯；RT-qPCR法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后MDA-MB-231細(xì)胞中EMT的上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin表達(dá)上調(diào)，使其獲得間質(zhì)化表型，即乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞在LPS的誘導(dǎo)下發(fā)生EMT，與金一等[15]的研究結(jié)果一致，與LPS誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生EMT[8]的研究結(jié)論相似。

綜上所述，LPS誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞通過(guò)下調(diào)E-cadherin表達(dá)與上調(diào)Vimentin和β-catenin表達(dá)調(diào)控EMT，而乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是多因素多步驟的復(fù)雜過(guò)程，對(duì)于LPS調(diào)控EMT的機(jī)制及可能存在的Wnt/β-catenin信號(hào)通路信號(hào)分子還有待進(jìn)一步探討。