黃薏佳，朱小媚，鐘碧華，宋佳堉，王術(shù)玲

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

薇甘菊(MikaniamicranthaKunth)，也稱小花蔓澤蘭或小花假澤蘭，是原產(chǎn)于中美洲和南美洲的一種菊科多年生草本植物，能攀附在其它灌木或樹(shù)木上瘋狂生長(zhǎng)，莖節(jié)可以隨地生根并進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，對(duì)自然生態(tài)造成嚴(yán)重危害，被認(rèn)為是世界十大有害雜草之一[1]。作為一種外來(lái)物種，薇甘菊在沒(méi)有天敵的情況下，在中國(guó)的繁殖能力極強(qiáng)，尤其在南方亞熱帶地區(qū)瘋狂生長(zhǎng)[2-3]。韓詩(shī)疇等[4]發(fā)現(xiàn)薇甘菊很少出現(xiàn)被昆蟲(chóng)啃咬的現(xiàn)象，推測(cè)其揮發(fā)油可能含有驅(qū)避昆蟲(chóng)或使昆蟲(chóng)拒食的物質(zhì)。薇甘菊揮發(fā)油化學(xué)成分主要是單萜類(lèi)及倍半萜類(lèi)物質(zhì)，如β-雪松烯、β-石竹烯、α-草烯等，這些成分被證明對(duì)昆蟲(chóng)、植物及微生物有不同程度的生物活性抑制作用。王振華[5]研制了含薇甘菊提取物的驅(qū)蚊止癢產(chǎn)品，并申請(qǐng)了專(zhuān)利。作者采用GC-MS法分析薇甘菊揮發(fā)油化學(xué)成分，采用GC法建立其GC指紋圖譜，并測(cè)定其中β-石竹烯的含量。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

10批薇甘菊均采自廣東省境內(nèi)。

環(huán)己烷，分析純，麥克林公司；無(wú)水硫酸鈉，分析純,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；水楊酸甲酯(批號(hào)B21198，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；β-石竹烯(批號(hào)B0709AS，純度≥90%)，大連美侖生物技術(shù)有限公司。

5890N-GC型氣相色譜儀,南京科捷分析儀器有限公司；Agilent 7890B-5977A型氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；揮發(fā)油測(cè)定器；電熱套；電子秤；分析天平；十萬(wàn)分之一天平。

1.2 GC條件

5890N-GC型氣相色譜儀。色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氮?dú)?，流?.0 mL·min-1，程序升溫：起始溫度70 ℃，保持2 min；以2.0 ℃·min-1升溫至120 ℃；再以40.0 ℃·min-1升溫至160 ℃，保持5 min；然后以5.0 ℃·min-1升溫至200 ℃，保持5 min。進(jìn)樣量1 μL，分流進(jìn)樣(1∶30)。

1.3 GC-MS條件

Agilent 7890B-5977A型氣相色譜-質(zhì)譜儀。氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為高純氦氣(He)，恒壓模式，進(jìn)樣口溫度240 ℃，程序升溫：起始溫度70 ℃，保持2 min；以2.0 ℃·min-1升溫至120 ℃；再以40 ℃·min-1升溫至160 ℃，保持5 min；然后以5 ℃·min-1升溫至200 ℃，保持5 min。進(jìn)樣量0.2 μL。質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源，轟擊源70 eV，離子源溫度230 ℃，流速1.5 mL·min-1，全掃描監(jiān)測(cè)模式，掃描范圍50～550 amu。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照溶液的制備

精密稱取β-石竹烯對(duì)照品22.675 mg，置于25 mL容量瓶中，加環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.907 mg·mL-1對(duì)照溶液。

1.4.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取水楊酸甲酯48.175 mg，置于25 mL容量瓶中，加環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.927 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4.3 供試溶液的制備

采集新鮮薇甘菊地上部分，去除殘根和雜質(zhì)，洗凈，剪碎；精密稱取100 g，置于1 000 mL燒瓶中，加入500 mL蒸餾水及5 mL環(huán)己烷，自揮發(fā)油測(cè)定器上端緩慢加水至溢流入燒瓶時(shí)為止；連接回流冷凝管；將燒瓶置于電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸3 h，待測(cè)定器中油量不增加時(shí)停止加熱；冷卻至室溫，開(kāi)啟測(cè)定器下端活塞，放出全部液體，移入分液漏斗中；用5 mL環(huán)己烷洗滌測(cè)定器內(nèi)壁，洗液移入分液漏斗中； 振搖，靜置分層；取上層，加無(wú)水硫酸鈉脫水；過(guò)濾，用少量環(huán)己烷沖洗濾紙，濾液移至10 mL容量瓶中，加環(huán)己烷稀釋至刻度，即得供試溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 薇甘菊揮發(fā)油化學(xué)成分的分析

取供試溶液，按1.3條件進(jìn)樣測(cè)定GC-MS圖譜(圖1)，分析薇甘菊揮發(fā)油的化學(xué)成分，結(jié)果見(jiàn)表1。其中8號(hào)峰經(jīng)分析鑒定為β-石竹烯。

圖1 薇甘菊揮發(fā)油的GC-MS圖譜

表1 薇甘菊揮發(fā)油的化學(xué)成分

Tab.1 Chemical components of volatile oil fromMikaniamicrantha

峰號(hào)化學(xué)成分保留時(shí)間/min相對(duì)含量/%1水芹烯3.340.512α-蒎烯3.451.233(-)-檸檬烯5.401.984γ-松油烯6.201.335異松油烯7.206.896(-)-α-蓽澄茄油烯19.202.287β-古巴烯21.4132.248β-石竹烯22.8017.089蛇麻烯(α-草烯,α-石竹烯)24.652.6210β-大根香葉烯26.256.8011蓽澄茄醇27.104.3512衣蘭油27.401.6513β-杜松烯27.952.4314蓽澄茄烯28.107.00

2.2 薇甘菊揮發(fā)油GC指紋圖譜的建立

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一批薇甘菊樣品，按1.4.3方法制備供試溶液，吸取1 μL注入氣相色譜儀，按1.2條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定GC圖譜。計(jì)算其相似度RSD為0.05%，表明儀器精密度較好。

2.2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批薇甘菊樣品6份，按1.4.3方法制備供試溶液，分別吸取1 μL注入氣相色譜儀，按1.2條件進(jìn)樣，測(cè)定GC圖譜。計(jì)算其相似度RSD為0.6%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批薇甘菊樣品6份，按1.4.3方法制備供試溶液，分別靜置0 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后吸取1 μL注入氣相色譜儀，按1.2條件進(jìn)樣，測(cè)定GC圖譜。計(jì)算其相似度RSD為1%，表明供試溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.4 薇甘菊揮發(fā)油的GC指紋圖譜

將采集的10批薇甘菊樣品，分別按1.4.3方法制備供試溶液，按1.2條件進(jìn)樣，測(cè)定GC圖譜。通過(guò)相似度軟件校正配對(duì)，得到10批薇甘菊揮發(fā)油的GC指紋圖譜疊加圖，如圖2所示。

圖2 10批薇甘菊揮發(fā)油的GC指紋圖譜疊加圖

將10批薇甘菊揮發(fā)油的GC數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件，得到10批薇甘菊揮發(fā)油的GC指紋圖譜共有模式，如圖3所示。

圖3 10批薇甘菊揮發(fā)油GC指紋圖譜共有模式

由圖3可知，10批薇甘菊揮發(fā)油的GC指紋圖譜有19個(gè)共有峰，相似度為0.80～0.95。

2.3 薇甘菊揮發(fā)油中β-石竹烯的含量測(cè)定

2.3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取0.907 mg·mL-1β-石竹烯對(duì)照溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，精密加入1.927 mg·mL-1水楊酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。吸取1 μL，按1.2條件進(jìn)樣，測(cè)定GC圖譜(圖4)。以β-石竹烯濃度(x)為橫坐標(biāo)、β-石竹烯與水楊酸甲酯的峰面積比(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程y=8.6117x+0.113，相關(guān)系數(shù)R>0.9999。表明，β-石竹烯在0.097 2～0.456 3 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積比呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 校正因子的測(cè)定

精密吸取0.181 4 mg·mL-1β-石竹烯對(duì)照溶液1 μL，按1.2條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算校正因子平均值為0.562 4(RSD=1.8%)。表明，儀器的精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按1.4.3方法制備供試溶液，精密加入1.927 mg·mL-1水楊酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。吸取1 μL， 按1.2條件進(jìn)樣6次，計(jì)算β-石竹烯平均含量為0.00268%，RSD為4.7%。表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按1.4.3方法制備供試溶液，分別靜置0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后進(jìn)樣分析，測(cè)定β-石竹烯和水楊酸甲酯的峰面積比，計(jì)算RSD為1.4%。表明，供試溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖4 β-石竹烯對(duì)照品(a)和薇甘菊揮發(fā)油(b)的GC圖譜

2.3.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取薇甘菊樣品50 g，置于1 000 mL燒瓶中，加入0.272 1 mg·mL-1β-石竹烯對(duì)照溶液5 mL，500 mL蒸餾水自揮發(fā)油測(cè)定器上端緩慢加入至溢流入燒瓶時(shí)為止，按1.4.3方法制備供試溶液，精密加入1.927 mg·mL-1水楊酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。吸取1 μL，按1.2條件進(jìn)樣6次。計(jì)算加標(biāo)回收率在100%～110%之間，平均加標(biāo)回收率為105%，RSD為5%。

2.4 討論

本實(shí)驗(yàn)分析得到的薇甘菊揮發(fā)油化學(xué)成分及含量與文獻(xiàn)報(bào)道有一定差異，而且所采集的10批樣品的GC指紋圖譜相似度也存在差異，說(shuō)明外來(lái)物種薇甘菊在新環(huán)境下特別是在脅迫條件下往往產(chǎn)生和釋放更多種類(lèi)和更高濃度的次生物質(zhì)[6]。同時(shí)，薇苷菊揮發(fā)油化學(xué)成分與產(chǎn)地、采收期、光照條件有關(guān)，鮮品薇苷菊揮發(fā)油與干品薇苷菊揮發(fā)油的化學(xué)成分也有所不同。比如，林蔭下的薇甘菊比被太陽(yáng)直射的路邊薇甘菊的揮發(fā)油成分含量普遍偏低，甚至缺少某些成分；老枝薇甘菊比嫩枝薇甘菊的揮發(fā)油成分含量更高。另外，提取時(shí)間也會(huì)影響薇苷菊揮發(fā)油化學(xué)成分。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了加熱提取5 h和3 h對(duì)薇甘菊揮發(fā)油化學(xué)成分含量的影響，結(jié)果表明，加熱時(shí)間5 h，14號(hào)峰(蓽澄茄烯)含量減少甚至消失，5號(hào)峰(異松油烯)含量明顯增加。與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致，故本實(shí)驗(yàn)選擇加熱提取時(shí)間為3 h。

3 結(jié)論

通過(guò)GC-MS法分析得到薇甘菊揮發(fā)油的14個(gè)化學(xué)成分的相對(duì)含量。10批薇甘菊揮發(fā)油的GC指紋圖譜顯示出19個(gè)共有峰，相似度為0.80～0.95，批間相似度差異較大。以水楊酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，采用GC法測(cè)定薇甘菊揮發(fā)油中β-石竹烯含量為0.00268%。該方法可為薇甘菊質(zhì)量控制提供參考。