閔芮涵，孫敏譯，吳 昀，李世琦，夏宜平

（浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 園林研究所，浙江 杭州310058）

百合Lilium spp.是百合科Liliaceae百合屬Lilium多年生草本球根植物，被譽為 “球根花卉之王”，具重要觀賞及食藥用價值[1]。百合鱗莖發(fā)育是影響百合質(zhì)量的關(guān)鍵過程，在百合生命周期中伴隨著源-庫關(guān)系的轉(zhuǎn)換[2]；采用離體手段開展百合小鱗莖發(fā)育生物學(xué)研究，具可控、高效、材料一致性強等優(yōu)勢[3]。百合鱗莖的主要儲藏物質(zhì)為淀粉，占干物質(zhì)量的60%以上，包括直鏈淀粉和支鏈淀粉，淀粉代謝被認為參與調(diào)控百合鱗莖發(fā)育[4]。淀粉合成酶（starch synthase,SS）是淀粉生物合成過程中的關(guān)鍵酶之一，主要有顆粒結(jié)合淀粉合成酶（granule-bound starch synthase,GBSS）和可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase,SSS）2種，分別參與直鏈和支鏈淀粉的合成。其中，GBSS能通過α-1,4-D-糖苷鍵將腺苷二磷酸葡萄糖中的葡萄糖殘基添加到葡聚糖的非還原端，延長葡聚糖的直鏈，是直鏈淀粉合成過程中的關(guān)鍵酶[5]；常見GBSSⅠ（30～70 kD）和 GBSSⅡ（70～100 kD）等 2 種同工酶。 目前， 已從擬南芥 Arabidopsis thaliana[6]、 馬鈴薯Solanum tuberosum[7]等植物中克隆得到GBSS基因，且發(fā)現(xiàn)GBSSI的缺失會造成直鏈淀粉的合成受阻，導(dǎo)致植物體內(nèi)直鏈淀粉缺失[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)：離體鱗莖促進型處理（低濃度多效唑，5×10-4mmol·L-1），GBSS酶活性顯著增強[9]。然而， 針對百合 GBSS基因的克隆及表達特性研究仍較匱乏[10]，制約了百合鱗莖發(fā)育機制的進一步深入探討。本研究以東方百合‘索邦’Lilium oriental‘Sorbonne’離體苗為材料，通過形態(tài)觀察和淀粉含量測定，判斷其庫-源關(guān)系轉(zhuǎn)換，準(zhǔn)確劃分小鱗莖膨大過程發(fā)育時期；結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，利用cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）克隆‘索邦’顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因（LohGBSS），并通過定量即時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)分析該基因在不同組織及發(fā)育時期的表達模式，為研究LohGBSS在離體百合淀粉合成及鱗莖發(fā)育過程中的調(diào)控機制和百合淀粉品質(zhì)育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為浙江大學(xué)園林研究所組培室的東方百合‘索邦’組培材料。無菌培養(yǎng)室光強為60 μmol·m-2·s-1， 溫度為（25±2） ℃。

1.2 研究方法

1.2.1 離體小鱗莖發(fā)育過程中的形態(tài)學(xué)觀測 根據(jù)本實驗室建立的鱗莖發(fā)育生物學(xué)研究體系獲得足量單芽[3]，并作一定改動（成球培養(yǎng)基為50 mL，試驗期可提供充足養(yǎng)分）。將芽轉(zhuǎn)入含MS（70 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂）[11]的成球培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入后0、15、25、35、45、55和75 d觀察并拍照，統(tǒng)計小鱗莖直徑和鮮質(zhì)量，計算 0～15（P1）、15～25（P2）、25～35（P3）、 35～45（P4）、 45～55（P5）和 55～75 d（P6）的鱗莖膨大速率。

1.2.2 離體小鱗莖發(fā)育過程中淀粉質(zhì)量分數(shù)的測定 對應(yīng)形態(tài)學(xué)觀測時間點，隨機選取生長狀況良好的小鱗莖，切掉葉片和根部，將剩余部位切碎混勻后稱量0.3 g，液氮速凍30 min后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存，采用蒽酮法測定淀粉質(zhì)量分數(shù)[1]，重復(fù)3次取平均值。計算P1、P2、P3、P4、P5和P6各期的淀粉累積率。

1.2.3 LohGBSS基因cDNA 5′和3′端序列的獲得 采用改良十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取‘索邦’鱗莖總RNA[1]，通過blastx數(shù)據(jù)庫對基因進行同源性比對，從前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中[1]得到LohGBSS cDNA序列片段，采用Beacon Designer 7軟件設(shè)計3′端和5′端RACE端引物。使用Clontech SMARTerRACE 5′/3′試劑盒（Takara 公司）合成第 1 鏈 cDNA， 克隆得到 LohGBSS cDNA 5′和 3′端序列（參照試劑盒）。對RACE產(chǎn)物進行回收、加Poly尾、純化，連接至pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α的感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.4 LohGBSS基因的qRT-PCR分析 利用實時熒光定量PCR技術(shù)對LohGBSS在不同組織（葉、莖段、鱗莖、根）及不同時期（0、15、45、60和75 d）的表達特性進行分析。根據(jù)LohGBSS的cDNA序列，設(shè)計特異引物，上游引物：5′-AGGAAGGATTCACTGGATT-3′，下游引物：5′-TTGGACATAGGAGCGATT-3′。 以GAPDH為內(nèi)參基因， 上游引物： 5′-GAATGGCAAGCTAACTGGAATG-3′， 下游引物： 5′-CAGCCTTGATCTGATCGTAAGT-3′。利用CFX ConnectTM 熒光定量 PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad公司）分析LohGBSS的表達特性。PCR反應(yīng)條件為：95℃，2 min；95℃，5 s；60℃，30 s；39個循環(huán)。用比較Ct值法計算相對表達量。重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 鱗莖膨大速率（g·株-1·d-1）=m鮮（1+n）-m鮮n/t， 淀粉積累率=[w淀粉（1+n）-w淀粉n]/w淀粉n， 其中：n=（1， 2， 3， 4， 5， 6）[1]， 即為相鄰取樣點， t為相鄰 2 次取樣間隔天數(shù)（d）。 運用 WPS Excel 2018 及SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鱗莖發(fā)育過程生長狀態(tài)

小鱗莖轉(zhuǎn)入成球培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基提供主要養(yǎng)分，離體植株持續(xù)發(fā)育。15 d時即可明顯觀察到根的形成，根數(shù)及根長不斷增加；葉片在轉(zhuǎn)接后5～6 d抽出，葉面積擴大；培養(yǎng)至45 d，葉片出現(xiàn)黃化（圖1）。小鱗莖直徑在實驗期間快速增長，至75 d時達1.93 cm（表1），小鱗莖鮮質(zhì)量具相似變化趨勢。以2次觀測間隔為階段， 計算鱗莖膨大速率可知： P2（15～25 d）時最高， 為 0.048 g·株-1·d-1（圖 2）。

表1 ‘索邦’離體小鱗莖發(fā)育形態(tài)指標(biāo)Table 1 Developmental morphological indexes of‘Sorbonne’ bulblets

圖1 ‘索邦’離體小鱗莖發(fā)育情況Figure 1 Growth status of‘Sorbonne’ bulblets during different developmental stages

圖2 ‘索邦’小鱗莖膨大速率變化Figure 2 Swelling rate changes during different developmental stages of‘Sorbonne’ bulblet

2.2 小鱗莖淀粉質(zhì)量分數(shù)變化

在小鱗莖發(fā)育期間，淀粉質(zhì)量分數(shù)總體呈遞增規(guī)律，但在15～45 d時變化不大，甚至略有下降（圖3A）；鱗莖膨大與淀粉質(zhì)量分數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.90。淀粉積累速率在P1（0～15 d）階段最高，為9.29，表明在小鱗莖膨大初期，淀粉需快速積累以供鱗莖形態(tài)建成，P2（15～25 d）階段迅速降低，之后變化趨于平穩(wěn)，但在P4（25～45 d）階段淀粉積累率出現(xiàn)負值，說明淀粉被消耗，可能用于地上部及鱗莖的庫源平衡，隨后又出現(xiàn)明顯積累（圖3B）。

圖3 ‘索邦’小鱗莖發(fā)育過程中淀粉質(zhì)量分數(shù)及積累率Figure 3 Changes in starch content and starch accumulation rate during different developmental stages of‘Sorbonne’ bulblet

2.3 ‘索邦’LohGBSS基因cDNA全長序列分析

采用5′RACE技術(shù)擴增得到1條長度為283 bp（圖4A）的基因序列，采用3′RACE技術(shù)擴增得到1條長度為769 bp（圖4B）的基因序列。將所得的5′和3′端序列與LohGBSS cDNA中間序列拼接，得到全長為1 913 bp的LohGBSS cDNA序列，包含1個1 665 bp的開放閱讀框（ORF），共編碼554個氨基酸（圖5）。

圖 4 LohGBSS 5′和 3′端 RACE 產(chǎn)物Figure 4 RACE product of 5′（A）and 3′cDNA （B）of LohGBSS

2.4 LohGBSS基因序列分析

將百合LohGBSS與其他植物GBSS基因的氨基酸序列在MEGA 6軟件中進行比對分析，并用Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：百合LohGBSS和蘭州百合、玉米Zea mays等親緣關(guān)系較近（圖 6）。

將百合LohGBSS基因編碼的氨基酸序列在NCBI Blastn中比對，發(fā)現(xiàn)該序列與蘭州百合（AJG44453.1）的同源性最高，達92.00%，與海棗Phoenix dactylifera（XP_008775302.1）的同源性達69.00%，與大豆Glycine max（XP_003556431.1）的同源性達67.00%。用DNAMAN軟件將LohGBSS氨基酸序列與GenBank中其他植物的GBSS序列進行比對，發(fā)現(xiàn)與蘭州百合、馬鈴薯、玉米的GBSS氨基酸序列一致性分別達86.36%、61.80%、59.55%（圖7）。

通過ProtParam軟件（http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam）分析發(fā)現(xiàn)：LohGBSS基因編碼的多肽分子量約為60.89 kD，推測的等電點為6.08，帶負電荷的氨基酸殘基數(shù)（天冬氨酸和谷氨酸）為65個，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)（精氨酸和賴氨酸）為61個，總平均疏水性為-0.112，為親水性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為28.12，表明該蛋白是穩(wěn)定的。通過TMHMM 2.0軟件對LohGBSS氨基酸序列的跨膜區(qū)進行分析，結(jié)果顯示：554個氨基酸全部位于膜外，表明該蛋白均不具有跨膜區(qū)，不是跨膜蛋白。利用SMART軟件對百合LohGBSS編碼的GBSS蛋白結(jié)構(gòu)域進行分析（圖8A），發(fā)現(xiàn)其具有1個淀粉合成酶催化域（Glyco_transf_5）和2個糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（Glyco_transf_1和Glyco_transf_1_4）。

利用SWISS-MODEL預(yù)測LohGBSS蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖8B），結(jié)果顯示：其與同為單子葉植物的水稻Oryza sativa GBSSⅠ催化域晶體結(jié)構(gòu)的一致性達69.29%，與大麥Hordeum vulgare GBSSI催化域結(jié)構(gòu)的一致性達44.82%。推測該基因可能是百合GBSSI基因，將其命名為LohGBSSI。

2.5 LohGBSSI基因表達分析

對LohGBSSI在‘索邦’不同組織中的表達進行分析（圖9A），發(fā)現(xiàn)60 d時LohGBSSI在鱗莖中的表達量最高，在葉中的表達量高于莖段，在根中的表達量最低。差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)：LohGBSSI在葉和鱗莖中的表達較莖段和根差異顯著，但兩者無顯著性差異，在莖段和根中的表達也無明顯差異。對鱗莖中LohGBSSI在‘索邦’不同發(fā)育時期的表達進行分析（圖9B），發(fā)現(xiàn)LohGBSSI在15 d時表達量最高，0～15 d增加幅度較大，其后開始減少，45 d之后變化較小，差異不顯著。

圖5 LohGBSS cDNA序列及其推測氨基酸序列Figure 5 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of LohGBSS in lily

圖6 植物GBSS基因氨基酸序列的聚類分析Figure 6 Phylogenetic analysis of GBSS from different plant species

圖7 百合GBSS與其他植物GBSS的同源性比較Figure 7 Comparison of GBSS in lily with that in other species

圖8 百合GBSS蛋白功能域分析和單體三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 8 Functional domains analysis and predicted monomer 3D structure of GBSS in lily

圖9 百合LohGBSSI在不同組織及不同取樣時間的相對表達量Figure 9 Relative expression of LohGBSSI in different tissues and different time

3 討論與結(jié)論

培養(yǎng)基中添加的蔗糖可保證小鱗莖膨大所需養(yǎng)分[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，若僅在轉(zhuǎn)接初期添加碳源，可獲得的最大小鱗莖直徑及鮮質(zhì)量分別為8.81 mm及256 mg；轉(zhuǎn)接75 d時，由于 “碳饑餓”的發(fā)生，鱗莖最終鮮質(zhì)量僅為160 mg[4]。本研究發(fā)現(xiàn)：通過使用充足的培養(yǎng)基，最大鱗莖直徑可達1.93 cm，為前者的2.19倍，鮮質(zhì)量可達2.02 g，為前者的7.89倍。表明加倍碳源可獲得2倍以上的鱗莖膨大效益。

離體條件，小鱗莖在發(fā)育過程中常是 “源-庫復(fù)合體”的狀態(tài)，會隨著發(fā)育過程不斷轉(zhuǎn)換，主要取決于培養(yǎng)基中的碳供應(yīng)[2]。在小鱗莖膨大初期（0～15 d），能量物質(zhì)主要來自于培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接芽快速響應(yīng)并形成小鱗莖，此時初生小鱗莖僅擔(dān)任 “庫”的功能，集中體現(xiàn)在淀粉合成相關(guān)基因如LohGBSSI在15 d時高表達（圖9A），且此時淀粉質(zhì)量分數(shù)亦有顯著積累（圖3A），表明淀粉積累為芽鱗片化（即小鱗莖形成）所必需。隨著葉片和根的不斷形成，在小鱗莖快速膨大期（15～55 d），葉片光合作用產(chǎn)生的同化物與培養(yǎng)基中的蔗糖共同供應(yīng)小鱗莖及植株的生長發(fā)育，此時的小鱗莖既擔(dān)任 “庫”的功能，也與葉片之間形成雙向運輸，擔(dān)任 “源”的功能，是 “源-庫復(fù)合體”的狀態(tài)。具體而言，25～45 d淀粉積累率出現(xiàn)負值（圖3B），淀粉被消耗，地上部葉片數(shù)增加（圖1）；相應(yīng)地，25～35 d時小鱗莖膨大速率跌至最低點（圖2B），可以推測此時同化物大多轉(zhuǎn)運至葉片，保證葉片的營養(yǎng)生長，小鱗莖主要擔(dān)負 “源”的功能。45 d后小鱗莖葉片面積幾乎無變化，小鱗莖內(nèi)部淀粉含量又開始迅速積累（圖3），膨大速率加快。45 d小鱗莖內(nèi)部LohGBSSI基因的相對表達量較15 d時顯著降低，但仍處于較高水平，這也與小鱗莖淀粉快速積累的結(jié)果相符（圖3）。因此，根據(jù)小鱗莖發(fā)育過程中淀粉積累速率及膨大速率，及其源-庫關(guān)系轉(zhuǎn)換，可將小鱗莖的膨大過程分為：0～15 d，小鱗莖膨大初期，此時主要為鱗莖形態(tài)建成；15～55 d，小鱗莖快速膨大期，以源-庫復(fù)合體的形式保證鱗莖膨大；55～75 d，小鱗莖膨大后期，鱗莖內(nèi)含物的進一步充實。百合離體大球在移栽后存活率高，且生長更快[1]，應(yīng)重點調(diào)控小鱗莖快速膨大期，關(guān)注其源-庫復(fù)合體的特殊狀態(tài)，這與吳沙沙[2]在‘索邦’地栽球的研究結(jié)果類似。

GBSSI主要負責(zé)植物直鏈淀粉的合成，過表達或抑制GBSSI基因的表達，會導(dǎo)致淀粉中直鏈淀粉的含量上升或降低[12]。關(guān)于GBSS的分子水平研究主要以水稻、小麥、馬鈴薯等作物的淀粉品質(zhì)育種為主。有研究表明：GBSSI既影響大麥籽粒淀粉支鏈淀粉濃度，還和支鏈淀粉的鏈長有關(guān)[13]。在木薯Manihot esculenta中，CRISPR-Cas 9介導(dǎo)的直鏈淀粉生物合成相關(guān)的2個基因的靶向突變，即蛋白靶向淀粉（PTST1）或顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS），可以降低或消除根淀粉中的直鏈淀粉含量[14]。GBSS的活性對馬鈴薯中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例、淀粉鏈長及結(jié)構(gòu)特性有很大影響[15]。

本研究用整齊一致的‘索邦’離體材料克隆得到LohGBSS（GenBank登錄號：MF101407.1）。LohGBSS cDNA全長為1 913 bp，開放閱讀框長1 665 bp，編碼554個氨基酸，編碼的蛋白分子量約60.89 kD，與蘭州百合GBSSI的同源性較高，達92%，與其他物種GBSSI的同源性達65%～69%，故推測該基因可能是百合GBSSI基因，將其命名為LohGBSSI。LohGBSSI編碼的蛋白具有1個以ADP-葡萄糖為葡萄糖供體的淀粉合成酶催化域和2個將糖分從活躍供體轉(zhuǎn)移至特定受體的糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明：其與水稻GBSSⅠ催化域晶體結(jié)構(gòu)十分相似，表明該蛋白具有淀粉合成功能。

在木薯中，GBSSI基因在莖的表達量最高，在塊根發(fā)育過程中僅在形成期和成熟期表達[16]；在黃芪Astragalus membranaceus中，GBSSI基因在毛狀根及根中的表達量高于莖和葉[17]。而LohGBSSI在‘索邦’的葉、莖段、鱗莖和根中均有表達，雖在鱗莖中的表達量最高，但與葉片無顯著差異（圖9），推測其可能在百合鱗莖和葉的直鏈淀粉合成中起重要作用；同時，不同發(fā)育階段的表達譜表明：其在小鱗莖發(fā)育的整個階段均有表達，尤其在鱗莖形態(tài)建成中發(fā)揮作用。這與木薯中的研究一致[16]。

綜上所述，本研究在測定東方百合‘索邦’形態(tài)和生理指標(biāo)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)離體百合鱗莖形成和發(fā)育過程中，鱗莖直徑及鮮質(zhì)量不斷增加，淀粉質(zhì)量分數(shù)總體呈現(xiàn)遞增趨勢，且根據(jù)鱗莖膨大速率及淀粉積累率，及其源-庫關(guān)系轉(zhuǎn)換，可將離體小鱗莖發(fā)育過程分為：小鱗莖膨大初期（0～15 d），小鱗莖快速膨大期（15～55 d）及小鱗莖膨大后期（55～75 d）；同時，淀粉在發(fā)育初期即需快速合成以保證鱗片化進程。進一步地，從鱗莖中克隆得到淀粉合成關(guān)鍵酶基因LohGBSSI的cDNA全長序列，得到其編碼氨基酸的理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)，通過序列比較和生物信息學(xué)軟件分析，推測該基因?qū)儆贕BSSI基因家族，LohGBSSI基因表達量與淀粉質(zhì)量分數(shù)相關(guān)。通過實時熒光定量PCR法，分析LohGBSSI在‘索邦’不同組織的表達情況，發(fā)現(xiàn)LohGBSSI基因在鱗莖和葉中表達顯著高于莖段和根，表明直鏈淀粉合成的最主要部位為鱗莖；不同發(fā)育時期鱗莖內(nèi)LohGBSSI的表達在15 d時最高，暗示鱗莖形成初期直鏈淀粉合成基因?qū)τ邝[莖形態(tài)建成具重要作用。本研究為后續(xù)解析淀粉合成關(guān)鍵酶基因GBSS在鱗莖發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)，也為百合進行淀粉相關(guān)基因修飾提供了依據(jù)。