付 豪,梅繼林,李慶琳,李曉寧

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

急性脊髓損傷(ASCI)為臨床常見(jiàn)的機(jī)械性損傷，一旦發(fā)生損傷通常會(huì)遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，且臨床恢復(fù)較難，為患者的運(yùn)動(dòng)功能及心理帶來(lái)巨大壓力[1]。夾脊電針對(duì)于急性脊髓損傷的療效目前已得到大量的臨床驗(yàn)證，但對(duì)于其確切作用機(jī)制的研究并無(wú)確切結(jié)論[2]。本研究通過(guò)夾脊電針治療急性脊髓損傷模型大鼠，統(tǒng)計(jì)各組大鼠前后運(yùn)動(dòng)功能及脊髓組織病理形態(tài)學(xué)及組織中IL-18、IL-1β及cleaved caspase-1表達(dá)的改變，旨在探究夾脊電針對(duì)急性脊髓損傷療效可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，雌性，體質(zhì)量為(220±10)g。所有大鼠均為正常飲食且分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室溫度保持在(25±1.0)℃，空氣濕度保持在50%，光照按照晝夜循環(huán)進(jìn)行。大鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，首先接受7天時(shí)間的適應(yīng)性飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)際相關(guān)的動(dòng)物使用關(guān)懷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器

大鼠白介素18酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(EK0592，中國(guó)博士德)；大鼠白介素1β(IL1β)ELISA檢測(cè)試劑盒(EK0393，中國(guó)博士德)；cleaved caspase-1(WL03450，中國(guó)Wanleibio)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(WLA004a，中國(guó)萬(wàn)類生物)；石蠟切片機(jī)(RM2235，德國(guó)Leica)；無(wú)水乙醇(10009218，中國(guó)國(guó)藥)；顯微鏡(DP73，日本OLUMPUS)；曙紅Y，醇溶(A600190，中國(guó)sangon)；蘇木精(H8070，中國(guó)Solarbio)；超純水系統(tǒng)(NW10LVF，香港Heal Force)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(QH01-9030A，上海精宏)；二甲苯(X112051，中國(guó)國(guó)藥)；電針儀(KWD-808 II，中國(guó)英迪)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

本次實(shí)驗(yàn)研究將大鼠按照隨機(jī)分配的方法分為Sham組(假手術(shù)組)、Model組(模型組)和EA組(夾脊電針組)3組，然后每組再按照3天和7天兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)分成兩個(gè)亞組，每組6例，應(yīng)用苦味酸溶液對(duì)大鼠進(jìn)行標(biāo)記。

2.2 模型制備及評(píng)價(jià)

在前期課題的基礎(chǔ)上，本次研究中主要研究了通過(guò)Allen′s法改良脊髓損傷大鼠模型的制備效果與制備方法[3]。在手術(shù)開(kāi)始前，對(duì)大鼠進(jìn)行12 h禁食，但可以飲水，準(zhǔn)備所需實(shí)驗(yàn)材料，大鼠稱重后，以3.5 mL/kg的劑量，采用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射，致大鼠麻醉，然后固定在捆綁板，在第8肋的位置處定位T10棘突，在此處備皮，消毒。再對(duì)大鼠脊柱T10節(jié)段確定之后，縱行將大鼠的背部皮膚切開(kāi)，切口長(zhǎng)3 cm，移除皮下筋膜，鈍性分離皮下組織，使T9～11節(jié)段的棘突暴露，然后剪斷，應(yīng)用小號(hào)止血鉗夾住脊板，直到脊髓組織暴露，操作過(guò)程中注意不要破壞脊髓組織。將10 cm玻璃管垂直放置于已暴露出的脊髓組織正上方，使5 g的砝碼沿玻璃管內(nèi)從頂端自由下落，撞擊下方脊髓，造成脊髓外力性損傷，脊髓局部用生理鹽水進(jìn)行反復(fù)沖洗，分層縫合傷口。

在砝碼下落撞擊后，大鼠出現(xiàn)明顯的尾部搖動(dòng)、痙攣扭動(dòng)、雙下肢回縮的情況，并且撞擊部位出現(xiàn)充血情況就表示造模成功[4-5]。

在大鼠麻醉蘇醒后，采用BBB評(píng)分對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估在3分以下的排除出本次實(shí)驗(yàn)。

2.3 干預(yù)方法

2.3.1 Sham組(假手術(shù)組) 在脊髓暴露后，不做造模及其他處理，直接將傷口縫合，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，與EA組大鼠每天同步固定30 min。

2.3.2 Model組(模型組) 在模型制備成功之后進(jìn)行傷口縫合，不開(kāi)展治療，與EA組大鼠每天同步固定30 min。

2.3.3 EA組(夾脊電針組) 在造模成功之后的3 h內(nèi)采用夾脊電針進(jìn)行治療[6]。取穴參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸圖譜，取大鼠雙側(cè)T9、T11節(jié)段夾脊穴進(jìn)行針刺；操作流程：應(yīng)用針灸針(華佗牌，規(guī)格：0.35 mm×13 mm)在消毒后進(jìn)行穴位的刺入，刺入4～5 mm，然后將電針兩極接在同側(cè)夾脊穴上,正極為上，時(shí)間為30 min，頻率為100 Hz，調(diào)節(jié)電流避免大鼠的背部肌肉出現(xiàn)抽動(dòng)且掙扎后停止的情況。按照該方案每天治療1次。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 BBB評(píng)分評(píng)定各組大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能 BBB評(píng)分法能根據(jù)臀、膝、踝、軀干等部位運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)情況，量化評(píng)價(jià)脊髓損傷大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能[7]，分值范圍為0～21分，在7分以內(nèi)屬于后肢關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)情況的內(nèi)容，8～13分屬于對(duì)運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)性與步態(tài)的評(píng)估，14～21分主要針對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中肢體精細(xì)運(yùn)動(dòng)能否完成進(jìn)行評(píng)估。所有大鼠分別在造模后3天、7天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用BBB評(píng)分法觀察各組大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能情況。

2.4.2 HE染色法觀察大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)變化 36只大鼠均在3天、7天兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行BBB評(píng)分后采用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)進(jìn)行腹腔注射，達(dá)到麻醉效果，在大鼠麻醉之后迅速斷頭致死，然后在冰盒上快速的于損傷處為中點(diǎn)進(jìn)行對(duì)脊髓組織的提取，大概2 cm，將其置于4%多聚甲醛緩沖液中進(jìn)行固定，保存?zhèn)溆?。包埋后切至厚度? μm的蠟片。在切片架按順序加入95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各2 min，然后將切片浸泡于蒸餾水中2 min，使切片脫蠟至水。通過(guò)蘇木-伊紅溶液染色，通過(guò)顯微鏡觀察染色組織的病理形態(tài)，并于200倍鏡下拍照。

2.4.3 ELISA法檢測(cè)大鼠脊髓組織IL-18、IL-1β表達(dá) 每組大鼠于3天、7天的時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行BBB評(píng)分后采用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)進(jìn)行腹腔注射，達(dá)到麻醉效果，在大鼠麻醉之后迅速斷頭致死，然后在冰盒上快速的于損傷處為中點(diǎn)取出長(zhǎng)度約為2 cm的組織，置于-80℃液氮中保存?zhèn)溆靡源M(jìn)行ELISA檢測(cè)。

2.4.4 IHC法檢測(cè)各組大鼠脊髓組織cleaved caspase-1表達(dá)情況 將固定后的脊髓組織修好塊后自來(lái)水流水沖洗4 h，酒精中脫水，二甲苯中固定，直至標(biāo)本透明為止，包埋后切成層厚為5 μm的薄片，放在60℃溫箱中2 h，烘干，脫蠟至水，隨后進(jìn)行IHC檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 BBB評(píng)分法觀察各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能

由表1可知，Sham組大鼠運(yùn)動(dòng)功能基本正常，Model組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙明顯，對(duì)比Sham組大鼠有明顯差異，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，觀察EA組大鼠的評(píng)分情況明顯有所上升，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明大鼠出現(xiàn)脊髓組織損傷后，運(yùn)動(dòng)能力下降，存在運(yùn)動(dòng)障礙，夾脊針刺治療可以有效的優(yōu)化并改善其運(yùn)動(dòng)能力。

3.2 HE染色觀察各組大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)變化

由封三彩圖1可見(jiàn)顯微鏡主要顯示為：Sham組大鼠脊髓組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、未觀察到有組織水腫或者出血壞死等異常情況。Model組大鼠脊髓組織表現(xiàn)出嚴(yán)重的組織疏松，空泡形成，神經(jīng)細(xì)胞較Sham組顯著減少，且細(xì)胞形態(tài)改變明顯，大量神經(jīng)元死亡，可以明顯看出炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況嚴(yán)重，還有一些核固縮與核染色情況明顯加深，傾向于細(xì)胞的一側(cè)，使得膠質(zhì)細(xì)胞更多，且隨時(shí)間推移呈加重趨勢(shì)。EA組3天時(shí)大鼠脊髓組織病理改變與Model組類似，對(duì)比Model組的情況來(lái)看，神經(jīng)細(xì)胞明顯變多，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況也變多，還會(huì)出現(xiàn)大量的膠質(zhì)細(xì)胞，這些情況相較于Model組有著明顯的減輕趨勢(shì);在7天的時(shí)間點(diǎn)上，整體結(jié)構(gòu)更加完整，大部分地方出現(xiàn)了神經(jīng)細(xì)胞，且細(xì)胞的形狀不規(guī)則，胞體及胞核正常。

表1 各組大鼠BBB評(píng)分比較分)

注：與Sham組比較,#P<0.05；與Model組比較,*P<0.05。

3.3 各組大鼠脊髓組織IL-18表達(dá)情況

由表2可知，Sham組中可以見(jiàn)到一小部分大鼠脊髓組織中存在的IL-18表達(dá)，以3天、7天作為時(shí)間節(jié)點(diǎn)觀察，在這兩個(gè)點(diǎn)上趨于穩(wěn)定。與Sham組相比，Model組大鼠脊髓組織IL-18表達(dá)出現(xiàn)了升高狀態(tài)，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而通過(guò)夾脊電針治療的方式展開(kāi)治療后，觀察到EA組大鼠脊髓組織IL-18表達(dá)出現(xiàn)下降狀態(tài)，7天節(jié)點(diǎn)與Model組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明大鼠脊髓組織促炎細(xì)胞因子IL-18出現(xiàn)升高情況主要是在大鼠的脊髓組織受到損傷的情況下，出現(xiàn)這種情況很可能表現(xiàn)出其參與脊髓炎癥反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用夾脊電針進(jìn)行針刺干預(yù)效果明顯，有效降低IL-18表達(dá)，減輕炎癥損傷情況。

表2 各組大鼠脊髓組織IL-18表達(dá)

注：與Sham組比較,#P<0.05；與Model組比較,*P<0.05。

3.4 各組大鼠脊髓組織IL-1β表達(dá)情況

由表3可知，Sham組大鼠脊髓組織中有一小部分IL-1β表達(dá)，以3天、7天作為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，在這兩個(gè)節(jié)點(diǎn)上具備穩(wěn)定的水平。Model組大鼠脊髓組織IL-1β表達(dá)出現(xiàn)了明顯升高，與Sham組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而通過(guò)夾脊電針治療的方式展開(kāi)治療后，EA組大鼠脊髓組織IL-1β表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，尤其是在7天節(jié)點(diǎn)上，與Model組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明在大鼠脊髓受到損傷的情況下，大鼠的促炎細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)相較于其他組大鼠有著明顯的升高趨勢(shì)，采用夾脊電針治療可以有效的降低IL-1β表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，使得炎癥損傷得到明顯恢復(fù)。

表3 各組大鼠脊髓組織IL-1β表達(dá)

注：與Sham組比較,#P<0.05；與Model組比較,*P<0.05。

3.5 IHC法檢測(cè)各組大鼠脊髓組織cleaved caspase-1表達(dá)情況

由圖2可知，Sham組大鼠脊髓中有一小部分cleaved caspase-1，主要呈現(xiàn)出棕黃色陽(yáng)性表達(dá)狀態(tài)，以手術(shù)后3天、7天作為主要的觀察點(diǎn)，整體呈現(xiàn)出穩(wěn)定的水平。觀察Model組大鼠，脊髓組織中的cleaved caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞密度值升高，與Sham組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EA組大鼠治療后，大鼠脊髓組織中cleaved caspase-1呈現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值下降的情況，而在3天、7天的時(shí)間節(jié)點(diǎn)上，EA組相較于Model組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與Sham組比較,#P<0.05；與Model組比較,＊P<0.05。圖2 各組大鼠脊髓組織cleaved caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值(n=6)

4 討論

“夾脊穴”靠近足太陽(yáng)膀胱經(jīng)與督脈，不僅具有局部的治療作用，同時(shí)能夠通過(guò)刺激背俞穴，從而疏通一身臟腑經(jīng)氣[8]。主要的治療方法是將夾脊電針的導(dǎo)線兩極接通脈沖電流，然后針刺入夾脊穴。根據(jù)現(xiàn)階段的研究可以得知，在脈沖電流接通之后，人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生電場(chǎng)，通過(guò)針刺的神經(jīng)影響，促進(jìn)纖維生長(zhǎng)，使得炎癥因子與營(yíng)養(yǎng)因子得到明顯釋放，起到調(diào)節(jié)作用[9-10]。李曉寧等[11]臨床發(fā)現(xiàn)，夾脊配合督脈電針治療脊髓損傷患者，在ASIA評(píng)分的改善中有著明顯的效果，并且對(duì)于MBI能力評(píng)分與感覺(jué)量表評(píng)分都能起到改善作用，相較于普通電針有著更加明顯的治療效果。吳磊[12]通過(guò)對(duì)ASCI模型大鼠實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)夾脊電針能夠改善SCI大鼠脊髓組織炎性損傷，促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

現(xiàn)有研究證實(shí)，Caspase家族因子介導(dǎo)了一系列炎癥反應(yīng)，在ASCI的繼發(fā)性損傷中起到了至關(guān)重要的影響[13]。在ASCI早期，Caspase家族炎性因子可作用于NLRP3信號(hào)通路，觸發(fā)其后一系列細(xì)胞、分子水平的炎性反應(yīng)，從而加重脊髓損傷。李慶琳等[14]經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),夾脊電針能有效抑制ASCI中細(xì)胞焦亡的過(guò)程，其作用機(jī)制與降低大鼠脊髓組織中NLRP3及caspase-1的表達(dá)有密切關(guān)系?；罨腃aspase-1通過(guò)進(jìn)一步加工pro-IL-1β和pro-IL-18，最終形成并釋放具有生物活性的IL-1β和IL-18，促使整個(gè)細(xì)胞焦亡過(guò)程完成。IL-1β屬于IL-1家族，是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，IL-18同屬白介素1家族分子，在分子結(jié)構(gòu)層面和生物功能上與IL-1β有明顯的相似性。過(guò)量的IL-1β和IL-18能夠介導(dǎo)生物體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，打破正常機(jī)體組織中促炎癥細(xì)胞因子和抑炎癥細(xì)胞因子之間的平衡，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，引起機(jī)體免疫功能紊亂，從而影響正常的生理功能。因此，Caspase-1、IL-1β與IL-18的水平能夠直接反應(yīng)機(jī)體內(nèi)炎性反應(yīng)的程度。

本研究結(jié)果顯示,在3天、7天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，Model組大鼠表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的神經(jīng)細(xì)胞受損；而EA組大鼠脊髓組織隨著治療的不斷進(jìn)行，對(duì)于神經(jīng)受損的病癥有著明顯的效果，可以見(jiàn)到許多神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)再生情況，減少了空泡的出現(xiàn)，而EA組大鼠的BBB評(píng)分提高的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)就有可能為此。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，觀察到脊髓損傷后模型組大鼠脊髓組織內(nèi)Caspase-1、IL-1β與IL-18水平較假手術(shù)組明顯上升；而在夾脊電針治療后，3天、7天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，Caspase-1、IL-1β與IL-18的水平顯著下降(P<0.05)，證實(shí)夾脊電針能夠通過(guò)調(diào)控ASCI大鼠脊髓組織內(nèi)NLRP3信號(hào)通路中的相關(guān)因子表達(dá)水平，從而改善ASCI大鼠運(yùn)動(dòng)功能。

綜上所述，夾脊電針能夠有效控制并減輕ASCI后脊髓組織的炎性損傷，促進(jìn)ASCI大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，該過(guò)程可能與下調(diào)脊髓組織中Caspase-1、IL-1β與IL-18的表達(dá)有關(guān)。