不同電子載體對丙酮丁醇發(fā)酵的影響研究

羅壹艷，劉孟熒，方利敏，周智友，李漢廣

不同電子載體對丙酮丁醇發(fā)酵的影響研究

羅壹艷，劉孟熒，方利敏，周智友，李漢廣*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室/江西省菌物資源保護與利用重點實驗室，江西 南昌 330045）

通過研究不同濃度的丁酸鈉、乙酸鈉、中性紅及組合添加中性紅與弱酸鹽等電子載體對菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)丁醇的影響。結(jié)果表明，丁酸鈉、乙酸鈉以及中性紅均可提高丁醇產(chǎn)量，其中中性紅效果最為顯著，當(dāng)添加量為3.0 g/L時，丁醇產(chǎn)量可達(dá)到（11.3±0.23）g/L，較對照組相比提高了51.7%；當(dāng)組合添加3.0 g/L中性紅與3.0 g/L丁酸鈉時，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量進(jìn)一步提升，分別達(dá)到了（12.2±0.25）g/L和（17.4±0.18）g/L，較對照組分別提高了64.9%和33.8%，與單獨添加丁酸鈉和中性紅相比，丁醇產(chǎn)量分別提高了32.6%和8.0%。說明組合添加中性紅與弱酸鹽對丁醇發(fā)酵有一定促進(jìn)作用。

丁醇；丙醇丁醇梭菌ART18；電子載體

隨著化石原料的快速消耗及全球環(huán)境的日益惡化，使尋找可替代化石能源的生物質(zhì)能源在近年來成為能源領(lǐng)域研究的熱點。丁醇是一種重要的基礎(chǔ)平臺化合物，在樹脂、橡膠、油漆、涂料及醫(yī)藥等工業(yè)中應(yīng)用廣泛[1]。而利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇在近年來逐漸成為能源可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分[2-3]，使得生物丁醇發(fā)酵研究得到全球科研工作者的廣泛關(guān)注。同時，因其具有能量密度高、揮發(fā)性低、腐蝕性小、燃燒性能好、熱值接近汽油等諸多優(yōu)勢[4]，被認(rèn)為是理想的第二代生物質(zhì)能源[5]。

在傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵過程中，產(chǎn)物產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率較低，原料成本過高等問題，是限制大規(guī)模生物丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。木薯因其適應(yīng)性強，可在干旱、酸性或貧瘠土壤中生長[6]，且淀粉含量高而被逐漸用于發(fā)酵生產(chǎn)丁醇[7-8]。目前，利用木薯粉作為單一發(fā)酵底物，發(fā)酵結(jié)束后往往產(chǎn)率較低，但可通過優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件提高底物利用率[9-11]，進(jìn)而實現(xiàn)木薯等薯類原料對玉米等糧食底物的替代，以降低發(fā)酵成本[12]。

在丁醇發(fā)酵代謝過程中，氫氣的產(chǎn)生及醇類的合成均需要消耗NADH，若NADH供應(yīng)不足，則導(dǎo)致溶劑產(chǎn)量較低，故而穩(wěn)定NADH的合成速率才能滿足菌種代謝過程的正常進(jìn)行[13-16]。通過添加電子載體[17]（中性紅[18]、次甲基藍(lán)[19]、卞精結(jié)晶紫（BV）[16]等）或加入氫化酶抑制劑[20]，抑制H2產(chǎn)生電子，促進(jìn)代謝流移動，加快NADH的合成，最終提高醇類物質(zhì)的合成[21]。另一方面，某些弱酸鹽在代謝過程中也起著不同的調(diào)控作用，有研究表明，丁酸鈉在發(fā)酵過程中能夠延緩菌種衰老，增強溶劑生產(chǎn)能力[17]；乙酸鈉通過促進(jìn)乙酰-COA合成乙酰乙酰-COA[22]，刺激乙酸激酶和丁酸激酶的活性[23]，進(jìn)而加強溶劑的合成。因此，抑制氫化酶活性、加速NADH的合成、延緩菌種衰老等均可使代謝流更大程度向丁醇合成方向流動，使溶劑產(chǎn)量大幅度提升。

本實驗以丙酮丁醇梭菌ART18（ART18）為出發(fā)菌株，以木薯粉為主要發(fā)酵底物，通過研究丁酸鈉、乙酸鈉、中性紅及組合添加中性紅和弱酸鹽等電子載體對丙酮丁醇發(fā)酵的影響，以期找到進(jìn)一步提高丁醇產(chǎn)量的調(diào)控因子，為丁醇發(fā)酵工業(yè)化代謝調(diào)控提供一定價值的前期探索。

1 材料與方法

1.1 菌 種

本實驗所用菌種丙酮丁醇梭菌ART18（ART18）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉 40，葡萄糖 60，胰蛋白胨 3，酵母浸粉 2，CH3COONH43，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.75，KH2PO40.75，瓊脂 20，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 60，胰蛋白胨 3，酵母浸粉 2，CH3COONH43，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.75，KH2PO40.75，pH自然，121 ℃滅菌15 min。

木薯發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：木薯粉 80，酵母浸粉 2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.5，KH2PO40.5，NaCl 0.01，對氨基苯甲酸 0.001，維生素B1 0.001，生物素0.000 01，121 ℃滅菌15 min。

1.3 方 法

1.3.1 原料的預(yù)處理 將木薯用小型粉碎機進(jìn)行粉碎，并過60目篩網(wǎng)進(jìn)行篩分以獲得粒徑一致的木薯粉，再將其按8%的比例加入到蒸餾水中，100 ℃條件下糊化10 min備用。

1.3.2 培養(yǎng)方法 孢子懸液100 ℃熱激80~90 s，涂布固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取固體平板菌落至種子培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h。將種子培養(yǎng)基以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)72 h。

1.3.3 不同濃度添加物對發(fā)酵的影響 向木薯發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的丁酸鈉、乙酸鈉和中性紅，以及中性紅與丁酸鈉（或乙酸鈉）的混合添加，以探究其對菌種ART18發(fā)酵產(chǎn)溶劑的影響。將不同濃度添加物過濾除菌，加入已經(jīng)滅好菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。

1.3.4 溶劑產(chǎn)量測定 發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，與1.21 g/L異丁醇（異丁醇作為內(nèi)標(biāo)）按1:4的比例混勻，用于氣相色譜檢測。色譜條件如下：PEG20M毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.4 μm），進(jìn)樣口溫度：240 ℃，檢測器溫度：240 ℃，柱溫：90 ℃，以氮氣作載氣，進(jìn)樣量0.4 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 丁酸鈉對丙酮丁醇發(fā)酵產(chǎn)溶劑的影響

在丙酮丁醇發(fā)酵過程中，丁酸鹽除緩沖作用外，也可作為發(fā)酵底物促進(jìn)丁醇合成，并提高丁醇代謝過程中關(guān)鍵酶酶活[24-25]。為探究其對菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)丁醇性能的影響，將不同濃度丁酸鈉（1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 g/L）添加到木薯發(fā)酵培養(yǎng)基中，以未添加的為對照，其實驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著丁酸鈉添加量的增加，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量先上升后下降，當(dāng)丁酸鈉的添加量為4.0 g/L時，丁醇和總?cè)軇┑臐舛冗_(dá)到最高，分別為（9.2±0.28）g/L和（14.6±0.25）g/L，與對照組相比，兩者產(chǎn)量分別提高了24.3%和12.3%。當(dāng)丁酸鈉的添加量超過4.0 g/L時，溶劑濃度呈下降趨勢，但相對于對照組而言仍有一定提高。與此同時，丁酸鈉濃度越高，丁醇占比越大。譚秀花[26]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)丁酸鈉添加量為0.5%時丁醇占比最高為68.1%，本實驗結(jié)果與這一結(jié)論一致。丁酸鈉的添加能提高丁醇產(chǎn)量的原因可能與其能夠促進(jìn)丁酸以及其它代謝途徑向丁醇的合成方向轉(zhuǎn)變，減少代謝支路以及抑制乙醇和丙酮的合成有關(guān)，從而提高丁醇在總?cè)軇┲械谋壤?/p>

圖1 不同濃度丁酸鈉對Clostridium acetobutylicum ART18發(fā)酵的影響

2.2 乙酸鈉對丙酮丁醇發(fā)酵產(chǎn)溶劑的影響

有研究表明，乙酸鈉可以促進(jìn)乙酰-COA合成乙酰乙酰-COA，并刺激乙酸激酶和丁酸激酶的活性，進(jìn)而加強溶劑的合成[24]。此外，Hüsemann等[27]認(rèn)為乙酸鈉在發(fā)酵過程中起調(diào)節(jié)pH促進(jìn)溶劑合成的作用；而Holt等[28]則認(rèn)為過量的乙酸鈉，會導(dǎo)致丁醇產(chǎn)量下降，但不影響丙酮的合成。因此，為探究其對菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)溶劑的影響，將不同濃度的乙酸鈉（1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 g/L）添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，以未添加的為對照，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，外源添加適當(dāng)濃度的乙酸鈉可以促進(jìn)丁醇和總?cè)軇┑暮铣伞．?dāng)乙酸鈉的濃度為1.5 g/L時，丁醇和總?cè)軇┑臐舛确謩e達(dá)到（8.8±0.31）g/L和（14.5±0.20）g/L，兩者較對照組相比分別提高了18.9%和11.5%。而當(dāng)乙酸鈉添加濃度為4.0 g/L時，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量極速下降。此外，隨著乙酸鈉添加量不斷增加，丁醇產(chǎn)量先上升后下降而丙酮的合成效果越好，從而導(dǎo)致丁醇占比先增加后極速下降。Qureshi等[29]報道，當(dāng)向發(fā)酵培養(yǎng)基（MP2）中添加適當(dāng)?shù)囊宜徕c可提高丁醇產(chǎn)量，與本實驗結(jié)果一致。乙酸鈉作為弱酸鹽加入發(fā)酵培養(yǎng)基后，在發(fā)酵后期測得其pH有所上升（數(shù)據(jù)未顯示），說明乙酸鈉具有穩(wěn)定pH的能力，可避免菌體因發(fā)酵液中的pH值較低而過早停滯。

圖2 不同濃度乙酸鈉對Clostridium acetobutylicum ART18發(fā)酵的影響

2.3 中性紅對丙酮丁醇發(fā)酵產(chǎn)溶劑的影響

中性紅作為電子載體能夠抑制氫化酶的活性，改變電子流向，提高NADH水平。在丁醇發(fā)酵過程中，因其能代替鐵氧化還原蛋白氧化還原酶傳遞電子和質(zhì)子，其常被添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，以促進(jìn)NAD(P)H合成，從而為丁醇和乙醇的合成提供充足的還原力[18]。圖3為不同濃度的中性紅（0.5、1.0、2.0、3.0及4.0 g/L）對菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)溶劑的影響。

由圖3可知，在菌種的代謝過程中，中性紅能夠提高菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)丁醇的能力，但對丙酮和乙醇的合成均有抑制作用。當(dāng)中性紅的添加量為3.0 g/L時，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量達(dá)到最高，分別為（11.3±0.23）g/L和（16.0±0.23）g/L，與對照組相比，分別提高了51.7%和23.5%。當(dāng)中性紅的添加量超過3.0 g/L時，丁醇和總?cè)軇┑暮铣墒艿揭种?，可能是電子載體本身是試劑染料，具有低毒性，當(dāng)添加量達(dá)到一定時會影響菌體的生長及代謝產(chǎn)物的合成。本實驗結(jié)果與譚秀花[26]所報道的隨著中性紅添加量不斷增加丁醇的產(chǎn)量先上升后下降和丙酮產(chǎn)量一直下降結(jié)果一致，但與徐芳[22]所提出的隨著中性紅的不斷添加，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量均呈下降趨勢的結(jié)論不一致。其可能原因是不同菌株對中性紅的耐受性不同。

圖3 不同濃度中性紅對Clostridium acetobutylicum ART18發(fā)酵的影響

2.4 中性紅與弱酸鹽復(fù)合添加對丙酮丁醇發(fā)酵產(chǎn)溶劑的影響

上述結(jié)果表明，丁酸鈉等弱酸鹽可以改善發(fā)酵液的pH，延緩菌種的衰老，并提升菌種的發(fā)酵性能，而中性紅對丁醇合成的促進(jìn)作用也十分明顯。為使菌種發(fā)酵產(chǎn)溶劑的性能進(jìn)一步提升，本次實驗在含有3.0 g/L中性紅的發(fā)酵液中分別加入不同濃度的弱酸鹽（乙酸鈉、丁酸鈉）（1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 g/L），來探究復(fù)合添加弱酸鹽和中性紅對菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)溶劑的影響，其實驗結(jié)果如圖4所示。

a：復(fù)合添加條件下不同濃度丁酸鈉對丁醇發(fā)酵的影響；b：復(fù)合添加條件下不同濃度乙酸鈉對丁醇發(fā)酵的影響

從圖4可觀察到，中性紅與乙酸鈉復(fù)合添加條件下，丁醇及總?cè)軇┊a(chǎn)量并沒有提升，反而隨著乙酸鈉濃度的升高而下降，而中性紅與丁酸鈉復(fù)合添加能進(jìn)一步提高丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量。當(dāng)丁酸鈉和中性紅的添加量均為3.0 g/L時，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量可達(dá)到（12.2±0.25）g/L和（17.4±0.18）g/L，與僅添加丁酸鈉的相比分別提高了32.6%和19.2%；與對照組相比，分別提高了64.9%和33.8%。說明一定范圍內(nèi)中性紅與丁酸鈉復(fù)合添加具有協(xié)同作用，可促進(jìn)菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)丁醇。

3 結(jié) 論

本研究主要探究了弱酸鹽及中性紅等電子載體的單獨添加及復(fù)合添加對菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)丁醇的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3.0 g/L的中性紅對丁醇的合成具有較大促進(jìn)作用，丁醇與總?cè)軇┑漠a(chǎn)量可到達(dá)（11.3±0.23）g/L和（16.0±0.23）g/L，與對照組相比，分別提高了51.7%和23.5%。且適宜濃度的丁酸鈉與乙酸鈉也可在一定程度上促進(jìn)丁醇的合成。當(dāng)復(fù)合添加3.0 g/L丁酸鈉與3.0 g/L中性紅時，菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)溶劑的能力可得到進(jìn)一步提高，丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量分別為（12.2±0.25）g/L和（17.4±0.18）g/L，與對照組相比分別提高了64.9%和33.8%。本研究結(jié)果表明適量添加弱酸鹽和中性紅可提高菌種ART18發(fā)酵木薯粉產(chǎn)丁醇的能力，本實驗結(jié)果可為通過代謝調(diào)控手段提高該微生物的工業(yè)適應(yīng)性提供一定價值的前期探索。

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Effects of Different Electronic Carriers on Acetone-butanol-ethanol Fermentation byART18

LUO Yi-yan, LIU Meng-yin, FANG Li-min, ZHOU Zhi-you, LIHan-guang*

(Jiangxi Key Laboratory for Conservation and Utilization of Fungal Resources/Jiangxi Engineering Laboratory for the Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources, College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In order to improve the acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation performance, the effects of different concentrations of electronic carriers, such as odium butyrate, sodium acetate, neutral red, and the combination of neutral red and weak acid salts, on butanol production from fermented cassava powder by theART18 were investigated. The results showed that sodium butyrate, sodium acetate and neutral red could increase butanol production, of which, relatively speaking, neutral red contributed significantly to the synthesis of butanol; when the addition of neutral red was 3.0 g/L, the butanol production reached (11.3±0.23) g/L, which was 51.7% higher than that of the control group; when 3.0 g/L neutral red and 3.0 g/L sodium butyrate were added in combination, the butanol and total solvent production were further increased, reaching (12.2±0.25) g/L and (17.4±0.18) g/L, respectively, and the butanol production and the total solvent production were 64.9% and 33.8% higher than that of the control. Meanwhile, the yield of butanol increased by 32.6% and 8.0%, higher than that of the addition of sodium butyrate and neutral red alone, respectively. It was showed that the combination of neutral red and weak acid salt could promote the fermentation of butanol.

butanol;ART18; electronic carrier

TQ 223.12+4

A

2095-3704（2020）01-0085-05

2019-12-15

國家自然科學(xué)基金（21466014）、江西省教育廳科學(xué)研究（GJJ160388）、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃（201810410015）和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動基金（9232305387）

羅壹艷（2000—），本科生，主要從事生物技術(shù)研究，1985992996@qq.com；*通信作者：李漢廣，副教授，博士，hanguangli@jxau.edu.cn。

羅壹艷, 劉孟熒, 方利敏, 等. 不同電子載體對丙酮丁醇發(fā)酵的影響研究[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2020, 43(1): 85-89.

10.3969/j.issn.2095-3704.2020.01.17