萬 婕，張 慜 *，劉亞萍

（1. 江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 廣東嘉豪食品有限公司，廣東 中山 528400）

雞骨架是雞肉類加工過程中的副產(chǎn)品，是所有畜禽骨肉中蛋白質(zhì)含量最高的原料，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)16.3%，與等量雞胸肉相似。鮮雞骨架質(zhì)量占整雞質(zhì)量的比例約為20%～22%，大致由71%的雞骨，22%的雞骨肉及6%的雞皮構(gòu)成。 新鮮雞骨中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)素，尤其是蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，此外鮮骨內(nèi)含有大量骨髓，主要由水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和微量元素等物質(zhì)構(gòu)成[1]。 目前，工業(yè)生產(chǎn)上對(duì)雞骨架的利用還存在利用途徑少、產(chǎn)品價(jià)值低等問題，其主要經(jīng)過粉碎烘干后作為寵物飼料，甚至直接丟棄[2]。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，食品加工、設(shè)備制造等技術(shù)的發(fā)展給骨類食品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展帶來了新的機(jī)遇，鮮骨加工產(chǎn)業(yè)的原料利用率和產(chǎn)品附加值有所提高，研究表明，骨蛋白酶解后釋放的氨基酸及多肽具有如下特點(diǎn)：加工性能提高，表現(xiàn)在酶解產(chǎn)物的溶解性、吸水性、保水性、乳化性、起泡性及持油性等方面[3，4]；功能性顯著，膠原多肽具有降血壓[5]、抗氧化[6]、促進(jìn)皮膚膠原代謝等生物活性與功能[7]；風(fēng)味增強(qiáng)，骨蛋白經(jīng)酶解后，具有肉的特殊鮮味與香味，可作為肉味香精的前體，通過后期的美拉德反應(yīng)可制備出各種風(fēng)味的香精調(diào)味料[8，9]。 因此，探究雞骨架的深加工技術(shù)和應(yīng)用，提高其產(chǎn)品附加值，對(duì)于充分利用低值蛋白資源具有重要意義。

近年來，有不少研究探討和報(bào)道了低值畜骨的綜合利用，其主要是利用蛋白酶酶解低值蛋白，實(shí)現(xiàn)低值蛋白源的高值化。 為了提高其酶解速率，一些研究者探索將部分新技術(shù)引入其中。 超聲波屬于一種彈性機(jī)械波[10]，其頻率范圍在 2×105～2×109Hz之間，在介質(zhì)中傳播時(shí)，可能產(chǎn)生熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)等，其中空化作用被認(rèn)為是影響超聲波在液體介質(zhì)中反應(yīng)速度和產(chǎn)率的主要原因。 空化作用可引起多種次級(jí)效應(yīng)，如湍動(dòng)效應(yīng)、微擾效應(yīng)、聚能效應(yīng)等[11]，這些效應(yīng)能夠改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和特性，強(qiáng)化提取過程、加速反應(yīng)進(jìn)程。 超聲波在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氣泡經(jīng)過擠壓破裂，能在瞬間產(chǎn)生較強(qiáng)的機(jī)械剪切力，對(duì)液體介質(zhì)中的大分子產(chǎn)生機(jī)械性斷鍵作用，從而促使更多親水基團(tuán)的暴露，有利于底物與酶的結(jié)合，提高蛋白質(zhì)的水解程度[12-14]。

作者以雞骨架為原料，采用Alcalase 堿性蛋白酶和Flavourzyme 風(fēng)味蛋白酶水解雞骨蛋白，以水解度、多肽含量等作為測(cè)試指標(biāo)，研究超聲波處理應(yīng)用于雙酶分步酶解雞骨蛋白，探討不同超聲條件對(duì)雞骨蛋白的酶解效果的影響，并針對(duì)其結(jié)果進(jìn)行機(jī)理初探。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：雞骨架，超市購(gòu)買，冷凍貯藏保存?zhèn)溆谩?/p>

Alcalase 蛋白酶、Flavourzyme 蛋白酶：諾維信公司產(chǎn)品；甲醛溶液、三氯乙酸、氫氧化鈉、硫酸銅、牛白蛋白、溴化鉀等試劑均購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2-16PK 型高速冷凍離心機(jī)：Sigma 公司產(chǎn)品；JY98-3D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；UV2600 型紫外分光光度計(jì)：Techcomap 公司產(chǎn)品；FA1004 型電子分析天平：上海舜寧恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品； 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)Starter 3100：奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；8S-1型磁力攪拌器：江蘇省金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；SSW-420-2S 型電熱恒溫水槽：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；真空冷凍干燥機(jī)：作者所在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)組裝。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雞骨蛋白酶解液的制備方法 將雞骨架解凍后清洗除去多余的血漬，去除雞皮及油脂，用粉碎機(jī)粉碎成雞骨泥，將雞骨泥與去離子水以1∶2 的質(zhì)量比混合，充分?jǐn)嚢韬?，?jīng)過110℃ 30 min 高溫高壓預(yù)處理，調(diào)節(jié)溫度和pH 值，酶解總時(shí)間為3 h，酶解完畢后沸水浴滅酶10 min，4 500 r/min 下離心15 min，過濾除去懸浮物與碎骨渣，即得酶解液。

酶解過程中采用超聲波輔助酶解的處理方式，即酶解雞骨蛋白的同時(shí)進(jìn)行超聲處理，超聲功率分別為 200、400、600、800、1 000 W，超聲工作時(shí)間/間歇時(shí)間2 s/2 s，超聲總時(shí)間分別設(shè)置為 20、40、60、80 min。

雙酶分步酶解的具體操作過程為：先用NaOH溶液和稀鹽酸調(diào)節(jié)雞骨泥勻漿的pH，首先調(diào)節(jié)pH值至8.5，向其中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的堿性蛋白酶，攪勻，55℃下恒溫酶解1.5 h 后；再將pH 值調(diào)節(jié)至7，向其中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的風(fēng)味蛋白酶，攪勻，50℃下恒溫酶解1.5 h，制得酶解液。

圖1 超聲波輔助酶解裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of ultrasound-assisted enzymolysis equipment system for chicken bone

1.3.2 水解度的測(cè)定 采用中性甲醛滴定法，即甲醛滴定出氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù) （具體參見國(guó)標(biāo) GB/T 5009.39-2003 中所述方法），凱氏定氮法測(cè)定出總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù) （具體參見國(guó)標(biāo) GB 5009.5-2010 中所述方法），兩者的百分比記為水解度。

1.3.3 多肽質(zhì)量濃度的測(cè)定 采用雙縮脲法[15]測(cè)定多肽含量，以牛白蛋白（BSA）作為標(biāo)樣，分別配置成0.5、1、2、3、4 mg/mL 的溶液，取 2 mL BSA 溶液與 3 mL 雙縮脲試劑均勻混合，靜置 30 min 后，于 540 nm 下，測(cè)定標(biāo)樣的吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品中多肽質(zhì)量濃度測(cè)定時(shí)，取2 mL 的多肽酶解液，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸，均勻混合后于4℃、4 000 r/min 高速冷凍離心20 min 得到上清液，取上清液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法，測(cè)定出相應(yīng)的吸光度值，按以下公式計(jì)算多肽質(zhì)量濃度。

式中：A 為吸光度值，n 為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 電子舌分析 取酶解液70 mL，分別倒入電子舌專用測(cè)試杯中，使液面低于刻度線0.5～1.0 mm，機(jī)器自動(dòng)測(cè)試4 次，分析時(shí)取后3 組實(shí)驗(yàn)的平均值，并轉(zhuǎn)化為各味覺的響應(yīng)值數(shù)值再輸出。 響應(yīng)值差異越大表明差異越大，正值表明該味覺比對(duì)照組強(qiáng)，負(fù)值則相反。

1.3.5 氨基酸組成測(cè)定 用10 g/dL 三氯乙酸等體積稀釋，放置1 h，保證溶液體系中TCA 終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，雙層濾紙過濾后，取1 mL 澄清濾液于1.5 mL離心管內(nèi)，10 000 r/min 下離心 15 min，后取 400 μL上清液于液相樣品瓶?jī)?nèi)，置于氨基酸分析儀上測(cè)定。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 采用溴化鉀（KBr）壓片法制片后置于配有DTGS 檢測(cè)器的IS 10 型傅里葉紅外光譜儀上進(jìn)行檢測(cè)。

將酶解液凍干后磨粉，再放入瑪瑙研缽中磨為細(xì)粉，加入適量的KBr 攪磨均勻，然后壓片待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲作用對(duì)酶解產(chǎn)物水解度及多肽含量的影響

由圖2 可知，隨著超聲功率的增加，雞骨蛋白酶解液的DH 及其多肽含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。 超聲波功率為200～600 W 時(shí)，雞骨蛋白的 DH 有顯著提高（P＜0.05），且在 600 W 時(shí)達(dá)到最大值，為17.99%，當(dāng)超聲波功率超過600 W 時(shí)，雞骨蛋白的DH 開始下降，1 000 W 時(shí)下降至14.13%；而超聲功率為200～800 W 時(shí)，雞骨蛋白酶解液的多肽質(zhì)量濃度呈上升趨勢(shì)，且在800 W 時(shí)達(dá)到最大值2.91 mg/mL，1 000 W 時(shí)酶解液的多肽質(zhì)量濃度下降至2.73 mg/mL。這可能是因?yàn)?，雞骨蛋白的空間結(jié)構(gòu)在適當(dāng)功率的超聲波作用下會(huì)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性部位暴露出來，與酶更好的結(jié)合，此外，超聲波的振蕩作用可以使酶與底物的碰撞幾率增大，促進(jìn)二者的結(jié)合，從而提高酶解產(chǎn)物的DH。 但當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，蛋白分子的活性部位、蛋白酶的分子構(gòu)象均會(huì)被損傷，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物DH 的下降[11]。

圖2 超聲功率對(duì)雞骨蛋白酶解液多肽質(zhì)量濃度及水解度的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on the peptides content and DH of chicken bone hydrolysate

圖3 表示的是超聲處理時(shí)間對(duì)雞骨蛋白酶解產(chǎn)物特性的影響。 隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，雞骨蛋白酶解液的DH 及多肽含量同樣呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，這與超聲功率所述規(guī)律一致。 當(dāng)超聲時(shí)間為30 min 時(shí)，DH 達(dá)到24%，多肽質(zhì)量濃度達(dá)到2.14 mg/mL，此后，延長(zhǎng)時(shí)間DH 及多肽質(zhì)量濃度反而下降。 這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間適宜時(shí)，超聲改變了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，加大了酶與底物的結(jié)合速率和產(chǎn)物的釋放速率[13]，從而促進(jìn)了酶解過程的進(jìn)行。然而隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲的空化作用和擾動(dòng)作用有可能使已游離的蛋白質(zhì)分子重新聚合，形成大分子物質(zhì)，底物分子構(gòu)象的改變進(jìn)而使其對(duì)酶解的促進(jìn)作用減弱[16]。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)雞骨蛋白酶解液多肽質(zhì)量濃度及水解度的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic time on the peptides content and DH of chicken bone hydrolysate

由于酶解過程中同時(shí)存在著兩個(gè)過程：蛋白降解成肽和氨基酸；多肽被進(jìn)一步降解成小分子肽和氨基酸。 兩個(gè)過程同時(shí)存在并產(chǎn)生“競(jìng)爭(zhēng)”關(guān)系，最終產(chǎn)物中肽的含量取決于誰在“競(jìng)爭(zhēng)”占得優(yōu)勢(shì)。 如果蛋白降解成肽的速度快于肽降解成氨基酸的速度，那么肽的質(zhì)量濃度則增加，若肽釋放成氨基酸的速度快于蛋白質(zhì)降解成肽的速度，則水解產(chǎn)物中的肽質(zhì)量濃度降低。 由圖2～3 可知，超聲作用可能會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)降解為多肽及多肽進(jìn)一步降解為氨基酸的過程。

表1 電子舌傳感器檢測(cè)不同超聲功率下的雞骨蛋白酶解液響應(yīng)值Table 1 Senor outputs of chicken bone hydrolysate obtained by the electronic tongue at different ultrasonic power

2.2 超聲作用對(duì)雞骨蛋白酶解液滋味的影響

表1 和表2 所示，在一定的超聲強(qiáng)度和時(shí)間內(nèi)，酶解液的滋味增強(qiáng)。 以酶解液的苦味響應(yīng)值來看，隨著超聲波功率的增強(qiáng)和超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，苦味的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，這基本與超聲對(duì)酶解液DH 的影響趨勢(shì)相同，而鮮味的規(guī)律趨勢(shì)與苦味大致相反。 研究表明，影響酶解液苦味的主要是苦味肽而不是游離氨基酸[17]。 有學(xué)者認(rèn)為[18]，DH 持續(xù)增大，苦味肽濃度增高，酶解產(chǎn)物的苦味越來越強(qiáng)，當(dāng)水解增大到一定程度，苦味肽被水解成小分子肽和游離氨基酸，它們難以滿足苦味形成的條件，所以酶解產(chǎn)物的苦味強(qiáng)度反而降低。 與苦味不同的是，酶解產(chǎn)物的鮮味主要受酶解過程中鮮味氨基酸的影響，所以呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。

表2 電子舌傳感器檢測(cè)不同超聲時(shí)間下的雞骨蛋白酶解液響應(yīng)值Table 2 Senor outputs of chicken bone hydrolysate obtained by the electronic tongue at different ultrasonic time

由圖4～5 可以看出，在最適超聲條件（800 W，30 min）下會(huì)引起苦味值增強(qiáng)，鮮味值下降，但就酶解液中兩者的閾值來看，鮮味值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于苦味值，且鮮味肽對(duì)苦味具有遮蔽作用[19-20]，繼續(xù)增強(qiáng)超聲強(qiáng)度雖然會(huì)使苦味值下降，鮮味值上升，但會(huì)引起酶解液的水解度及多肽含量下降。

圖4 雞骨蛋白酶解液在不同超聲功率下的苦味值和鮮味值Fig. 4 Bitterness and umami values of chicken bone hydrolysate at different ultrasonic power

圖5 雞骨蛋白酶解液在不同超聲時(shí)間下的苦味值和鮮味值Fig. 5 Bitterness and umami values of chicken bone hydrolysate at different ultrasonic time

2.3 超聲作用對(duì)雞骨蛋白酶解液氨基酸的影響

從表3 中可以看出不同處理方式的雞骨蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸組成和總量的差異，雖然色氨酸沒有測(cè)出，但必需氨基酸（包括組氨酸）占到了總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的40%以上，其中對(duì)照組比例（沒有加入超聲波進(jìn)行輔助酶解）為49.51%，超聲波處理組的比例為51.52%。 酶解過程中，雞骨蛋白被逐漸分解成小分子肽和游離氨基酸，這些游離氨基酸包括鮮(甜)味氨基 酸 ，如 Glu、Asp、Ser、Thr、Gly、A1a等，苦味氨基酸，如 Phe、Val、Leu、Ile、Tyr、His、Arg、Lys 等，這些呈味氨基酸的含量和所占比例會(huì)影響酶解產(chǎn)物風(fēng)味的形成。 由表3 中可以看出，經(jīng)過超聲處理后，鮮味氨基酸和苦味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所提高，雖然苦味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加（尤其是苯丙氨酸、亮氨酸）有可能增添酶解產(chǎn)物的不愉悅風(fēng)味，但由于苦味氨基酸的呈味閾值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鮮味氨基酸，所以對(duì)酶解液呈味評(píng)價(jià)的負(fù)面影響降低。

表3 酶解產(chǎn)物的氨基酸組成Table3 Amino acid composition of hydrolysate from chicken bone %

2.4 超聲作用對(duì)雞骨蛋白結(jié)構(gòu)影響的探究

由圖6 比較可得，雞骨蛋白在酶解前和酶解后的吸收峰出現(xiàn)了較大的差異，主要表現(xiàn)在：3 300 cm-1附近的酰胺A 帶（表征N-H 伸縮振動(dòng)）、3 100 cm-1附近的酰胺B 帶 （被認(rèn)為是酰胺Ⅱ帶的一次泛頻，費(fèi)米共振）、1 660 cm-1附近的酰胺Ⅰ帶 （表征C=O伸縮振動(dòng)）、1 570 cm-1附近的酰胺Ⅱ帶（表征N-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)和C-N 伸縮振動(dòng)）以及1 300 cm-1附近的酰胺Ⅲ帶（表征C-H 伸縮振動(dòng)和N-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)）。 另外，對(duì)比圖6 中酶解液有無超聲處理得到的吸收峰值（EH 和EHUS）可知，超聲處理組使得其吸收峰值藍(lán)移，其原因可以由酰胺 A 帶（3400～3440 cm-1）藍(lán)移現(xiàn)象為例進(jìn)行解釋：酰胺A 帶是 N-H 或 O-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，超聲處理破壞了蛋白分子間的氫鍵，而N-H 基團(tuán)的分子肽段參與了氫鍵形成，所以造成藍(lán)移現(xiàn)象[21]。

圖6 雞骨蛋白及其酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析Fig. 6 The infrared spectrogram of chicken bone and the hydrolysate from chicken bone

為進(jìn)一步探究超聲處理對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響，圖7對(duì)上述4 種樣品光譜圖中的酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）進(jìn)行曲線擬合。酰胺Ⅰ帶對(duì)于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究具有重要意義，其主要對(duì)與肽鍵有關(guān)的氫鍵敏感。 有研究表明，超聲波的機(jī)械作用和空化作用會(huì)破壞蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，打亂蛋白質(zhì)分子不同化學(xué)鍵之間的聯(lián)系。 表4 顯示，超聲處理會(huì)使雞骨蛋白緊密的α 螺旋結(jié)構(gòu)打開，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)由未處理前的30.71%降為處理后的23.86%，這與黃丹丹等人[21]研究的超聲預(yù)處理使金槍魚皮膠原蛋白α 螺旋降低的變化趨勢(shì)一致。 這可能是因?yàn)槌暡ㄊ沟玫鞍踪|(zhì)分子間的氫鍵斷裂，蛋白分子活性位點(diǎn)被更多的暴露，從而使得酶解產(chǎn)物的DH 和活性肽段釋放效率得到提高。

圖7 雞骨蛋白及其酶解產(chǎn)物的酰胺I 帶曲線擬合Fig. 7 Curvefitted results of amide I bands

表4 雞骨蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析Table 4 The secondary structure of chicken bone

3 結(jié) 語

超聲波處理有助于促進(jìn)雞骨架的水解，超聲輔助雞骨蛋白水解的最適條件為：超聲功率800 W，超聲時(shí)間30 min，此條件下，DH 可達(dá)24%。 氨基酸和電子舌分析表明，超聲處理使得酶解液中鮮味氨基酸含量提升，鮮味增強(qiáng)。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明，超聲會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使其活性位點(diǎn)被更多的暴露，從而提高了酶解過程中的DH 和活性肽段的釋放效率。

研究結(jié)果表明，超聲波處理雖然可以提升酶解產(chǎn)物的多肽含量及氨基酸含量，但提升幅度較小。超聲處理在提高水解度的同時(shí)也會(huì)使苦味增強(qiáng)，但相較于鮮味，苦味響應(yīng)值較小且呈味閾值較高，所以其負(fù)面影響有限。