王根杰，李德美，張亞東，辛 聞，王宗義

（北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院/農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京102206）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，簡稱 EC），是一種已經(jīng)被認(rèn)定為具有致癌作用的物質(zhì)，并廣泛存在于發(fā)酵食品和酒精飲料中[1][2]。

葡萄酒中EC 的來源有多種途徑，而葡萄釀酒酵母代謝產(chǎn)生過量的尿素與發(fā)酵產(chǎn)生的酒精結(jié)合是生成EC 的主要途徑[3][4]。 因此，酵母本身的菌種特性也會影響葡萄酒中EC 的含量。葡萄園土壤中的含氮量是影響葡萄樹體及果實中氮素分布的因素之一，葡萄植株通過根系吸收營養(yǎng)物質(zhì)維持葡萄果實的生長[5]。 葡萄果實中的酵母可利用氮（yeast assimilable nitrogen，簡稱 YAN）是由游離的NH4+、氨基酸氮和精氨酸代謝產(chǎn)物（主要是尿素和鳥氨酸）3 部分構(gòu)成[6]。由于尿素是EC 的主要前體物質(zhì)，因此YAN 的含量會最終影響葡萄酒中的EC 水平[7]。葡萄酒發(fā)酵過程中，為避免氮源含量過低而導(dǎo)致發(fā)酵受阻，常添加酵母助劑保證發(fā)酵完全。 然而，酵母助劑用量過多，也會促進(jìn) EC 的生成[8]。

作者選擇不同品種、酵母和不同用量酵母助劑進(jìn)行發(fā)酵試驗，比較北京房山和河北懷來產(chǎn)區(qū)葡萄酒中EC 產(chǎn)量的差異。通過分析比較，篩選出適合該產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)低EC 產(chǎn)量葡萄酒的工藝條件，為葡萄酒產(chǎn)區(qū)鑒別提供可行性，同時也為我國葡萄酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：“美樂”（Merlot） 和 “赤霞珠”（Cabernet Sauvignon）葡萄：采自于河北懷來和北京房山，成熟度良好；葡萄釀酒商業(yè)酵母：ST、BO213、F15 以及酵母助劑THIAZOTE：法國LAFFORT 公司產(chǎn)品；銨離子氮試劑盒和氨基酸氮試劑盒：愛爾蘭Megazyme 有限公司產(chǎn)品；EC 標(biāo)準(zhǔn)品、EC-d5 內(nèi)標(biāo)品：美國Sigma 公司產(chǎn)品；乙腈（色譜級）：韓國SK chemicals 公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6410 串聯(lián)液質(zhì)儀：美國 Agilent 公司產(chǎn)品；雙波長紫外分光光度計；北京Lab-Tech 公司產(chǎn)品；超純水系統(tǒng)：上海Canrex 分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗設(shè)計

選用酵母ST 和BO213 進(jìn)行發(fā)酵試驗，研究發(fā)酵過程中同種酵母釀造的美樂葡萄酒中的EC 產(chǎn)量在房山和懷來產(chǎn)區(qū)的差異。 酵母ST 和BO213 的添加量均為0.2 g/L，在葡萄入罐12 h 后添加。

選擇懷來產(chǎn)區(qū)的美樂和赤霞珠葡萄進(jìn)行發(fā)酵試驗，在均選用F15（添加量為0.2 g/L）為釀酒酵母的條件下，研究同一產(chǎn)區(qū)不同品種在添加酵母助劑THIAZOTE 后葡萄酒中的EC 產(chǎn)量差異。 酵母助劑THIAZOTE 的添加量分別為 0.0、0.3、0.6 g/L，記為YNCK、YN0.3、YN0.6。

發(fā)酵前期溫度控制在20～22 ℃，每12 小時進(jìn)行一次壓帽操作； 發(fā)酵中期溫度控制在25～28 ℃，每12 小時進(jìn)行2 次壓帽操作； 發(fā)酵后期溫度控制在22～25 ℃，不進(jìn)行壓帽操作。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的測定 土壤中銨態(tài)氮含量的測定采用氯化鉀（KCl）浸提-靛藍(lán)比色法；土壤中硝態(tài)氮含量的測定采用紫外分光光度法[9]。

1.4.2 葡萄中酵母可利用氮含量的測定 采用試劑盒檢測氨基酸態(tài)氮和銨離子氮含量[10]。

1.4.3 葡萄酒中主要理化指標(biāo)含量的測定 根據(jù)國標(biāo)GB/T 15038-2006 《葡萄酒、 果酒通用分析方法》測定[11]。

1.4.4 葡萄發(fā)酵液或葡萄酒中EC 含量的測定 利用EC-d5 作內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測定，可以有效校正整個分析過程產(chǎn)生的誤差，使樣品處理更為簡易，降低了對人員熟練程度的要求[12][13]。

1.4.5 液相色譜-質(zhì)譜條件 XSELECT HSS T3 色譜柱 （2.1 mm×150 mm，3.5 μm），Zorbax Eclipse Plus-C18預(yù)柱（12.5 mm×2.1 mm，5 μm）。 柱溫為 40 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL，流速為 0.3 mL/min；流動相 A 為體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸水溶液，B 為乙腈； 梯度洗脫順序如表1 所示。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 The sequence of gradient elution

1.4.6 校正標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程 按照內(nèi)標(biāo)法測定EC 含量得到的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，線性回歸方程為y=7.9197x+0.006，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，方程線性較好，適合本試驗中EC 的質(zhì)量濃度測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，對兩個產(chǎn)區(qū)葡萄酒中的理化指標(biāo)含量進(jìn)行多重比較分析。 利用Excel 繪制發(fā)酵過程中的EC 產(chǎn)量變化圖。

圖1 內(nèi)標(biāo)法測定EC 的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 The EC calibration standard curve

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中含氮量和葡萄中YAN、葡萄酒中的EC含量分析

氮是植物生長的必需元素[14]。 土壤中的氮素主要通過根系的吸收轉(zhuǎn)移到葡萄樹體，維持葡萄植株中氮的正常供應(yīng)。 土壤中的水解性氮（包括銨態(tài)氮、硝態(tài)氮）含量與葡萄中的酵母可利用氮含量以及葡萄酒中的EC 含量有著密切的關(guān)系[15]。房山和懷來產(chǎn)區(qū)“美樂”葡萄園土壤中的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量、葡萄原料中的YAN 含量以及葡萄酒中的EC 質(zhì)量濃度如表2。

由表2 可知，不同產(chǎn)區(qū)同一品種葡萄園土壤中的含氮量（主要為硝態(tài)氮和銨態(tài)氮）、葡萄原料中的YAN 含量和葡萄酒中的EC 質(zhì)量濃度均不同。 同時，土壤中氮含量高的葡萄原料中的YAN 含量也較高，最終葡萄酒中的EC 質(zhì)量濃度也較高，這與朱亞楠[15]對葡萄園土壤和葡萄原料中的氮含量與葡萄酒中的EC 質(zhì)量濃度關(guān)系的研究結(jié)果一致。

表2 “美樂”葡萄園土壤和葡萄原料中的含氮量和葡萄酒中EC 質(zhì)量濃度Table 2 The nitrogen of Merlot vineyard and EC content in‘Merlot’ wine

2.2 葡萄酒中理化指標(biāo)的檢測

葡萄酒發(fā)酵結(jié)束后，葡萄酒經(jīng)過澄清、分離及穩(wěn)定性處理后，過濾裝瓶。在瓶儲室（溫度10～15℃，濕度65%～70%）存放2 個月后，取樣測定葡萄酒中的理化指標(biāo)含量。

由表3 可以看出，酵母ST 和BO213 在房山和懷來兩個產(chǎn)區(qū)釀造的葡萄酒中理化指標(biāo)含量無明顯差異。 葡萄酒中的主要理化指標(biāo)含量均滿足酒精度≥7.0%，還原糖≤4 g/L 和揮發(fā)酸≤1.2 g/L 的要求。 葡萄酒質(zhì)量狀況正常，滿足葡萄酒中EC 含量的測定要求。

表3 “美樂”葡萄酒的理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indexes of ‘Merlot’ wine

2.3 葡萄酒發(fā)酵過程中EC 產(chǎn)量的變化

葡萄酒發(fā)酵是酵母利用營養(yǎng)物質(zhì)代謝將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的過程。 適量的無機(jī)氮源對酵母生長有促進(jìn)作用[16]。 在葡萄酒發(fā)酵過程中，酵母優(yōu)先利用的氮源主要是氨基酸和多肽等小分子物質(zhì)[17]。在葡萄發(fā)酵液中氨基酸含量過高時，酵母代謝會產(chǎn)生過量的尿素，尿素排出酵母細(xì)胞會與發(fā)酵過程產(chǎn)生的酒精結(jié)合生成EC。 酵母ST 和BO213 在房山和懷來產(chǎn)區(qū)葡萄酒釀造過程中的EC產(chǎn)量變化差異如圖 2（a）、（b）。

由圖2 可以看出，葡萄酒發(fā)酵過程中EC 產(chǎn)量是變化的，發(fā)酵初期、中期階段葡萄酒中EC 產(chǎn)量較低，在發(fā)酵末期階段葡萄酒中EC 產(chǎn)量較高。圖2（a）中可以看出，葡萄酒發(fā)酵過程中，酵母ST 在房山和懷來產(chǎn)區(qū)釀造的美樂葡萄酒中EC 產(chǎn)量的變化趨勢一致，且與懷來產(chǎn)區(qū)相比，房山產(chǎn)區(qū)“美樂”葡萄酒釀造過程中EC 產(chǎn)量更高。在發(fā)酵末期階段，房山產(chǎn)區(qū)“美樂” 葡萄酒中的EC 產(chǎn)量積累與懷來產(chǎn)區(qū)相比，增加了 28.0%。 圖 2（b）中可以看出，葡萄酒發(fā)酵過程中，酵母BO213 在房山和懷來產(chǎn)區(qū)釀造的“美樂”葡萄酒中EC 產(chǎn)量變化趨勢一致。 在發(fā)酵中期、末期階段，與懷來產(chǎn)區(qū)相比，房山產(chǎn)區(qū)釀造的美樂葡萄酒中EC 產(chǎn)量分別增加了25.6%和24.5%。

圖2 同種酵母在不同產(chǎn)區(qū)釀造的美樂葡萄酒發(fā)酵過程中EC 產(chǎn)量的差異Fig. 2 The comprison of EC content in Merlot wine fermented by the same yeast from different regions

2.4 在發(fā)酵過程中添加同種酵母助劑對EC 產(chǎn)量的影響差異分析

葡萄酒發(fā)酵過程中，酵母營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，會導(dǎo)致葡萄酒發(fā)酵遲緩甚至停滯。 因此，在葡萄酒發(fā)酵過程中常添加酵母助劑保證發(fā)酵正常進(jìn)行。 酵母助劑中的主要成分是磷酸氫二銨，可以加快發(fā)酵速率，使發(fā)酵完全。 然而磷酸氫二銨含量過高，也會產(chǎn)生EC。 懷來產(chǎn)區(qū)“美樂”和“赤霞珠”葡萄酒添加同種酵母助劑不同用量釀造的葡萄酒中EC 產(chǎn)量變化見圖3。

由圖3 可以看出，在使用同種酵母F15 發(fā)酵過程中，不同酵母助劑用量處理釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量差異明顯。 添加酵母助劑后，在發(fā)酵中期、末期階段，YNCK、YN0.3、YN0.6 三者相比，“美樂”和“赤霞珠” 葡萄酒中的EC 產(chǎn)量積累高低順序均為YN0.6＞YN0.3＞YNCK。在葡萄酒發(fā)酵過程中，添加同一酵母F15 助劑釀造的“美樂”和“赤霞珠”葡萄酒中EC 產(chǎn)量相比，“赤霞珠” 葡萄酒中的EC 產(chǎn)量較高。 在發(fā)酵末期階段，與“美樂”葡萄酒相比，YNCK、YN0.3 和YN0.6 在“赤霞珠”葡萄酒中的 EC 產(chǎn)量分別增長了30.0%、24.5%和27.6%。 這可能與葡萄品種本身特性和葡萄細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控基因有關(guān)。

圖3 添加同種酵母助劑不同用量在不同品種葡萄酒發(fā)酵過程中EC 產(chǎn)量的差異比較Fig. 3 The comprison of EC content in different wines fermented by the same yeast nutrients with different dosages

2.5 “美樂”葡萄酒中EC 質(zhì)量濃度測定結(jié)果

葡萄酒在發(fā)酵結(jié)束后，懷來和房山產(chǎn)區(qū)的葡萄酒放置在相同的條件 （溫度10～15 ℃，濕度65%～70%） 下貯存，2 個月后取樣測定葡萄酒中的EC 含量如表4。

由表4 可以看出，不同酵母釀造的“美樂”葡萄酒中EC 質(zhì)量濃度不同，同時可以看出不同產(chǎn)區(qū)釀造的美樂葡萄酒中的EC 含量不同。 房山產(chǎn)區(qū) “美樂”葡萄酒中的EC 質(zhì)量濃度均高于懷來產(chǎn)區(qū)，葡萄酒中的EC 質(zhì)量濃度均低于10 μg/L，符合葡萄酒中的 EC 限量標(biāo)準(zhǔn)[18]。

表4 “美樂”葡萄酒中的EC 質(zhì)量濃度Table 4 EC content in Merlot wine

3 結(jié) 語

主要研究了葡萄酒發(fā)酵過程中不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒中EC 產(chǎn)量的差異。 對葡萄園土壤和葡萄原料中的含氮量與葡萄酒中的EC 產(chǎn)量關(guān)系表明，葡萄園土壤和葡萄原料中的含氮量與葡萄酒中的EC 產(chǎn)量變化趨勢一致。 在“美樂”葡萄酒發(fā)酵過程中，結(jié)果表明酵母ST 和BO213 釀造的葡萄酒中的EC 產(chǎn)量在懷來和房山產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)不同，懷來產(chǎn)區(qū)葡萄酒中的EC 產(chǎn)量要低于房山產(chǎn)區(qū)。 這可能主要與葡萄園土壤環(huán)境、葡萄園栽培管理有關(guān)。

另外，分析比較了懷來產(chǎn)區(qū)“美樂”和“赤霞珠”葡萄酒發(fā)酵過程中，添加同種酵母助劑釀造的葡萄酒中EC 產(chǎn)量的差異。結(jié)果表明，在葡萄酒發(fā)酵過程中，同種酵母助劑在不同品種釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量不同。 在發(fā)酵末期階段，房山產(chǎn)區(qū)葡萄酒中EC產(chǎn)量的積累量均高于懷來產(chǎn)區(qū)。

試驗測定的葡萄酒為發(fā)酵過程中的發(fā)酵液和發(fā)酵結(jié)束的原酒，葡萄酒中的EC 含量測定結(jié)果范圍為 1.0～7.4 μg/L，均低于 10 μg/L，符合葡萄酒中EC 限量標(biāo)準(zhǔn)，這也朱亞楠等對葡萄原酒中測定的EC 含量較低的結(jié)果一致。 通過試驗，可以說明在現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝條件下，釀造的葡萄酒中的EC 產(chǎn)量處于較低水平，不會造成葡萄酒在EC 方面的安全問題。