黃 玲 ，李記明 ，李蘭曉 ，徐 巖 ，唐 柯 *

（1. 江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫，214122；2. 張裕葡萄釀酒股份有限公司 研發(fā)中心，山東 煙臺，264000）

冰葡萄酒是利用-8℃的氣溫下，在葡萄架上自然冰凍的葡萄釀造而成的葡萄酒 （Vintners Quality Alliance，VQA），其獨(dú)特的釀造工藝使其與普通葡萄酒在風(fēng)味特征上具有較大差異。 中國桓仁地區(qū)因其具備釀造冰葡萄酒的典型的氣候特征，現(xiàn)在已經(jīng)成為世界上重要的冰葡萄酒生產(chǎn)地之一。 隨著中國冰葡萄酒市場的逐漸擴(kuò)大，冰葡萄酒也越來越受到廣大消費(fèi)者的歡迎[1]。 然而中國冰葡萄酒尚存在風(fēng)格特點(diǎn)不明確的問題，并且在品質(zhì)上較世界主要冰酒產(chǎn)國（加拿大、德國等）生產(chǎn)的冰葡萄酒還有待改善[2]，而解析和確定冰葡萄酒中的香氣成分是實現(xiàn)冰葡萄酒風(fēng)味調(diào)控、提高冰葡萄酒品質(zhì)的首要問題。

近年來，葡萄酒中揮發(fā)性成分的檢測分析主要基于一維氣相色譜[3]。 李艷霞等[4]采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用對威代爾冰葡萄酒中的香氣成分進(jìn)行了分析，分離并定性了其中的59種香氣化合物，主要為酯類、醇類、酸類和呋喃類化合物。 隨后，王玉峰等[5]、秦紹智等[6]、王蓓等[7]分別采用溶劑萃取法結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用、液液萃取結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用以及攪拌棒吸附萃取結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用等方法對不同葡萄品種冰葡萄酒（包括赤霞珠、威代爾及雷司令冰葡萄酒）中主要香氣成分進(jìn)行了分析。 在氣-質(zhì)聯(lián)用的基礎(chǔ)上，馬玥等[8]進(jìn)一步采用固相萃取結(jié)合嗅聞 （gas chromatography-olfactometry，GC-O）對威代爾冰葡萄酒中具有重要貢獻(xiàn)的香氣化合物展開了研究，并在威代爾冰酒中檢測出對冰酒香氣有重要貢獻(xiàn)的3-甲硫基丙醛及菠蘿酮等之前未報道過的冰葡萄酒中重要的香氣活性物質(zhì)[9]。 這些研究豐富了對冰葡萄酒中香氣化學(xué)成分的認(rèn)識并對冰葡萄酒風(fēng)味輪廓的解析奠定了基礎(chǔ)。

然而，常規(guī)的一維氣相色譜經(jīng)常出現(xiàn)樣品中色譜峰重疊的現(xiàn)象并影響定性結(jié)果的準(zhǔn)確性。 相對于一維氣相色譜，全二維氣相色譜具有更高的分辨率、靈敏度以及峰容量，已廣泛用于復(fù)雜體系樣品的分離分析[10]。 國外已經(jīng)將全二維氣相色譜大量的用于酒精飲料（如葡萄酒[11]、伏特加[12]、啤酒[13]、利口酒[14]等）、奶制品[15]、茶[26]等的風(fēng)味成分的剖析，而國內(nèi)也已有應(yīng)用于白酒[17]、露酒[18]、醋[19]、中藥[20]、龍井茶[21]等揮發(fā)性成分分析的報道。 但目前利用全二維氣相色譜對冰葡萄酒的研究還鮮有報道。 因此作者采用全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法（comprehensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC × GC-TOFMS）對冰葡萄酒中揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，這不僅為后續(xù)深入研究冰葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味輪廓的化學(xué)組成及香氣呈香機(jī)理提供了技術(shù)支撐，也為進(jìn)一步改善冰葡萄酒品質(zhì)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

威代爾冰葡萄酒：煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司產(chǎn)品；C5-C30 正構(gòu)烷烴：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)（Agilent 7890N 氣相色譜）：美國 Agilent 公司產(chǎn)品；KT-2001冷噴調(diào)制器：美國Zoex 公司產(chǎn)品；Pegasus 4D 飛行時間質(zhì)譜儀：美國Leco 公司產(chǎn)品。

2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 三相萃取頭、固相微萃取裝置：美國Supelco 公司產(chǎn)品；B11-2 型恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司產(chǎn)品；B150/7.5 × 15 mm 磁力攪拌子：山東新華公司產(chǎn)品；電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

頂空固相微萃取[9，17]：取 8 mL 冰葡萄酒樣品置于20 mL 頂空樣品瓶中，加入3 g 氯化鈉及攪拌子。萃取溫度50 ℃，樣品平衡5 min，萃取45 min，轉(zhuǎn)速250 r/min。萃取結(jié)束后進(jìn)樣，將萃取頭置于GC 進(jìn)樣口（250 ℃）解析附 5 min。

氣相色譜條件：色譜柱：一維色譜柱DB-FFAP（60 m × 0.25 mm ID，0.25 μm），二維色譜柱 Rxi-17Sil MS（1.1 m × 0.25mm ID，0.25 μm）。 色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，以不分流模式進(jìn)樣。 一維柱溫箱升溫程序：起始溫度 45 ℃保持 2 min，以 4 ℃/min 的速率升溫至230 ℃并保持15 min。 調(diào)制器調(diào)制時間4 s，熱調(diào)制時間為 1 s，調(diào)制補(bǔ)償溫度為 20 ℃。 二維柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升溫至250 ℃并保持5 min。以高純氦氣作為載氣，恒流模式，流量：1 mL/min。

飛行時間質(zhì)譜條件：采用EI 離子源，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，電壓控制70 eV。檢測器采集質(zhì)量數(shù)范圍35～400，采集頻率100 spectrum/s，電壓控制1 430 V。 數(shù)據(jù)由LECO 公司Pegasus 4D工作站采集。

數(shù)據(jù)處理：利用儀器自帶ChormaTOF 軟件對采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，色譜峰的峰寬分別設(shè)為24 s 和0.2 s，自動識別信噪比大于200 的色譜峰后進(jìn)行自動積分解卷積和質(zhì)譜庫（mainlib，Wiley 9 和replib）比對，進(jìn)一步通過保留指數(shù)（保留指數(shù)根據(jù)C5-C30計算得出）定性并剔除烷烴類等無明顯風(fēng)味貢獻(xiàn)及胺類等主要呈味的化合物，選擇相似度及反相似度不小于800 的化合物作為最終鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分定性分析

基于全二維氣相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用的方法，共在威代爾冰葡萄酒中檢測到953 個色譜峰，如圖1 所示。

圖1 威代爾冰葡萄酒GC × GC-TOFMS 分析一維及二維總離子流圖Fig. 1 GC × GC -TOFMS total 1D and 2D ion chromatogram of volatile compounds of Vidal icewine

通過Pegasus 4D 工作站對質(zhì)譜庫的檢索結(jié)合保留指數(shù)比對，共定性了其中的253 種香氣化合物，其中包括酯類53 種，醇類40 種，芳香族化合物39 種，萜烯類 35 種，醛酮類 25 種，呋喃類 21 種，酸類12 種，硫化物9 種，內(nèi)酯類9 種，其他雜環(huán)化合物 10 種（圖 2）。 相較于一維 GC-MS 對冰葡萄酒香氣的分析[4-9，22]，GC × GC-TOFMS 表現(xiàn)出更好的分離效果。 例如，在威代爾冰葡萄酒中檢測到的2-糠酸乙酯、β-環(huán)檸檬醛和γ-戊內(nèi)酯一維出峰時間均為1696 s，但在二維上（出峰時間分別為 8.4、15.1 s 和17.9 s）能夠很好的分離得到3 個單獨(dú)的色譜峰。

圖2 威代爾冰葡萄酒鑒定出化合物種類及數(shù)目Fig. 2 Classification of volatile compounds qualified in Vidal icewine

在鑒定出的揮發(fā)性成分中，酯類、醇類及芳香族化合物占所有化合物的52%。 酯類在葡萄酒中主要呈果香，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯等呈香蕉菠蘿等熱帶水果的香氣。 除飽和脂肪鏈酯類外，還檢測到丙烯酸丁酯、2-己烯酸乙酯、9-癸稀酸乙酯等不飽和脂肪酸酯。 醇類也是葡萄酒中重要的風(fēng)味化合物，如順-3-己烯醇通常表現(xiàn)出青草的清香。 芳香族中苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇等均在葡萄酒中表現(xiàn)出花香，同時檢出的百里香酚、愈瘡木酚、4-乙基愈瘡木酚、 丁香酚等可提供煙熏煙草的香氣。

萜烯類化合物主要來源于用于釀酒的葡萄中，是葡萄酒一類香氣品種香的重要組成[23]。 作者共檢測到35 中萜烯類化合物（表1）。 王蓓等[7]利用攪拌棒吸附萃取結(jié)合一維氣-質(zhì)聯(lián)用在威代爾冰葡萄酒中檢測到24 種萜烯類化合物Ma 等[9]通過GC-OMS 在威代爾冰葡萄酒中共檢測到11 種萜烯。 作者鑒定出的 3-p-薄荷烯、 月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、（E）-羅勒烯、 胡椒酮、cis-冬青油醇等化合物均未在基于一維氣-質(zhì)威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分檢測中有過相關(guān)報道。 3-p-薄荷烯、胡椒酮在葡萄酒中主要呈現(xiàn)薄荷的清香，月桂烯呈天竺葵和藥香，水芹烯呈水果和薄荷的香氣[24]，但這些香氣化合物在冰葡萄酒中的風(fēng)味貢獻(xiàn)有待進(jìn)一步研究。 β-大馬酮、玫瑰醚分別呈蜂蜜和花香，在冰葡萄酒模擬液中閾值分別為 1.05 μg/L、0.09 μg/L[25]，這兩種化合物被報道對冰葡萄酒香氣具有重要貢獻(xiàn)[8-9]。 TDN（1，1，6-三甲基-1，2-二氫萘）在葡萄酒中呈現(xiàn)汽油味，是雷司令葡萄酒中的典型香氣特征，王蓓等[7]關(guān)于威代爾冰葡萄酒香氣成分的分析中也曾檢測到該化合物。

含硫化合物其低閾值及獨(dú)特的香氣特征使其成為現(xiàn)今食品風(fēng)味研究的一個熱點(diǎn)。 大多數(shù)的揮發(fā)性硫化物被認(rèn)為是異嗅化合物，但也有部分硫化物對食品的風(fēng)味特征具有重要作用。 據(jù)報道，糠硫醇是芝麻香型白酒中呈現(xiàn)其獨(dú)特芝麻香氣的關(guān)鍵化合物[17]。目前冰葡萄酒中關(guān)于硫化物的報道還較少，本研究在威代爾冰葡萄酒中檢測到了9 種硫化物，分別是二甲基硫、甲硫醇、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙醛、2-噻吩甲醛、4-甲基-5-乙烯基噻唑、2-甲硫基乙酸乙酯、 順-2-甲基-4-丙基-1，3-氧硫雜環(huán)己烷、3-乙硫基丙醇。 其中3-甲硫基丙醛在冰葡萄酒中主要表現(xiàn)為煮土豆的香氣特征，并且對冰葡萄酒整體香氣感知具有顯著影響[9]。 二甲基硫表現(xiàn)為白菜、蘆筍、玉米和糖漿的香氣。 這些硫化物在冰葡萄酒中的具體貢獻(xiàn)和作用目前還并不明晰，是否對冰葡萄酒的香氣起修飾作用或是增加冰葡萄酒的復(fù)雜性，這些問題均有待進(jìn)一步研究。

表1 威代爾冰葡萄酒中的萜烯類化合物Table 1 Terpenes in Vidal icewine

續(xù)表1

2.2 威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分相對含量

根據(jù)定性出的化合物的出峰時間及峰面積繪制氣泡圖（圖3），氣泡的大小表示峰面積的大小，由圖可知，酯、醇、酸、芳香族化合物峰面積較高，而大多數(shù)呋喃、醛酮、內(nèi)酯、硫化物、萜烯等峰面積均較低。 其中相對含量（峰面積占總化合物峰面積比例）高于 0.5%的化合物有 31 種 （表 2），包括乙酸、己酸、異丁醇、正己醇、1-丁醇、1-丙醇、1-辛烯-3-醇、1-戊醇、3-辛醇、1，2-丙二醇、順-3-己烯醇、2，3-丁二醇、1-庚醇、乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯、糠醛、乙醛、3-羥基-2-丁酮、苯甲醛、2，4-二叔丁基苯酚、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、4-萜品醇、脫氫芳樟醇、橙花醇氧化物。 其大部分為酯類和醇類，還包括3 種萜烯化合物，這些化合物構(gòu)成了冰葡萄酒揮發(fā)性組分的主體，可能為冰葡萄酒提供馥郁的果香、花香。 Ma 等[9]通過重組缺失實驗發(fā)現(xiàn)菠蘿酮和3-甲硫基丙醛對威代爾冰葡萄酒焦糖的香氣具有重要影響，說明香氣化合物對葡萄酒整體香氣的貢獻(xiàn)并不完全取決于其含量。 同時，萜烯、硫化物等痕量化合物具有較低的閾值，因此，進(jìn)一步通過確定痕量化合物的含量并結(jié)合閾值等探究其對冰葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)及價值，能夠更全面深入的了解冰葡萄酒的風(fēng)味輪廓。

圖3 威代爾冰葡萄酒中揮發(fā)性化合物分布Fig. 3 Scatter plot of volitale compounds in Vidal icewine

表2 相對面積分?jǐn)?shù) （峰面積占化合物總峰面積比例） 高于0.5%的香氣化合物Table 2 Aroma compounds in Vidal icewine with relative peak area over 0.5%

續(xù)表2

3 結(jié) 語

采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法分析了威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分，共定性了其中的253 種香氣化合物，其中，共檢測到35 種萜烯和9 種含硫化合物。 3-p-薄荷烯、月桂烯、α-水芹烯、β-水芹烯、（E）-羅勒烯、胡椒酮、cis-冬青油醇等萜烯化合物均未在一維氣-質(zhì)威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分檢測中有過相關(guān)報道。 同時，對香氣化合物相對含量進(jìn)行了分析，其中相對面積分?jǐn)?shù)（峰面積占總化合物峰面積比例）高于0.5%的香氣化合物有31 種，這些化合物可能是形成冰葡萄酒香氣的重要組成部分。 但由于香氣化合物對葡萄酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)不僅取決于化合物的含量，也受其閾值的影響。 一些低閾值的痕量化合物如萜烯、硫化物等也可能會對冰葡萄酒香氣具有重要影響，因此這些化合物對冰葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)有待結(jié)合精確的定量分析進(jìn)行進(jìn)一步的研究。