鄧 婷，余志杰，徐 穎，李勁松，孫 濤

(1.成都中醫(yī)藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137; 2.廣元市第一人民醫(yī)院，四川 廣元 628017)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，它是以記憶力下降、認知功能障礙，并出現(xiàn)語言和運動障礙、人格改變等為臨床特征。據(jù)2016年流行病學統(tǒng)計，全球AD患者已超過4 700萬，預(yù)計到21世紀中期將增加到1.31億以上，同時估計全球治療AD總費用為8 180億美元[1]，因而AD的防治已成為當前社會亟待解決的重大醫(yī)學、社會和經(jīng)濟問題。AD主要病理特征包括神經(jīng)元胞外老年斑(senile plaques，SPs)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失等。目前，AD的機制涉及多種假說，主要有β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)毒性、氧化應(yīng)激、Tau蛋白異常磷酸化等。盡管AD已被廣泛研究，但該疾病的發(fā)病機制尚不清楚，妨礙有效治療的發(fā)展。因此，我們需要適當?shù)哪Ｐ蛠硌芯緼D的發(fā)病機制和治療方法。

目前，研究AD的方法主要包括動物模型和細胞模型。動物模型能真實模擬動物體內(nèi)AD的病理特征；而細胞模型能在微觀層面研究AD的發(fā)病機制，并可根據(jù)研究目的的不同選擇構(gòu)建適宜的細胞模型。然而，目前總結(jié)AD細胞模型方法的文獻報道較少。因此，本文將從造模試劑、細胞模型建立方法及評價指標等方面對建立AD細胞模型的方法進行綜述，進一步梳理各細胞模型的特點，并根據(jù)造模物質(zhì)的神經(jīng)毒性、氧化應(yīng)激、Tau蛋白異常磷酸化等作用機制方面對其進行分類總結(jié)，旨在為后續(xù)研究AD的發(fā)病機制及相關(guān)藥物開發(fā)提供參考。

1 造模試劑

1.1 神經(jīng)毒性損傷

1.1.1Aβ Aβ來自于其前體淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)第672～711殘基裂解片段，APP經(jīng)β-和γ-分泌酶連續(xù)剪切后形成長度在39～42個氨基酸的短肽。APP表達量增多時，導(dǎo)致Aβ過量產(chǎn)生，從而造成Aβ積聚形成SPs。據(jù)報道，Aβ可直接或間接對線粒體結(jié)構(gòu)及功能造成損傷，進而誘發(fā)氧化應(yīng)激、激活凋亡信號通路等級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致大量的神經(jīng)元細胞損傷[2]。此外，Aβ積聚也會導(dǎo)致Tau蛋白過度磷酸化、突觸連接障礙、炎癥反應(yīng)等。目前研究常采用20 μmol·L-1濃度的Aβ1-42、Aβ25-35誘導(dǎo)細胞建立AD細胞模型。

1.1.2谷氨酸 谷氨酸(glutamate，Glu)是大腦中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，同時也被認為是新皮質(zhì)和海馬錐體神經(jīng)元的主要神經(jīng)遞質(zhì)，涉及認知功能等方面。研究表明，谷氨酸能神經(jīng)元位于AD中受影響的區(qū)域，其作用是通過控制突觸中谷氨酸的濃度，將神經(jīng)沖動轉(zhuǎn)化為化學刺激，并在突觸前神經(jīng)元中通過2個囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(vesicular glutamate transporter，VGLUT)1和VGLUT2維持儲存在囊泡中的谷氨酸水平[3]。當神經(jīng)元去極化時，過量的谷氨酸被釋放到突觸間隙，導(dǎo)致突觸前和突觸后神經(jīng)元上的谷氨酸受體過度刺激，造成鈣大量涌入、活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)及最終的神經(jīng)細胞死亡[4]。目前谷氨酸常采用10 μmol·L-1的濃度誘導(dǎo)細胞建立AD模型。

1.1.3甲醛 甲醛(formaldehyde，F(xiàn)A)是毒性最強的有機化合物之一，廣泛分布于生物體和環(huán)境中。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者尸檢的海馬中FA水平顯著升高，因此AD的發(fā)病機制與甲醛密切相關(guān)。文獻報道FA異常升高與認知障礙有關(guān)，如學習能力下降和記憶喪失；其也可促進AD的主要病理特征形成，包括Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化和神經(jīng)元丟失，同時伴有細胞功能障礙甚至細胞凋亡[5]。研究采用0.35 mmol·L-1的FA誘導(dǎo)N2a細胞，導(dǎo)致細胞凋亡率增高，Tau蛋白過度磷酸化[5]。

1.1.4甘油醛 甘油醛(glyceraldehyde，GA)呈劑量依賴性地促進神經(jīng)細胞中GA衍生晚期糖基化終末產(chǎn)物(GA-AGEs)的產(chǎn)生。GA-AGEs主要存在于海馬和海馬旁回的神經(jīng)元中，具有強烈的神經(jīng)毒性，研究表明，經(jīng)0.7 mmol·L-1GA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞出現(xiàn)凋亡；另外，細胞內(nèi)產(chǎn)生GA引起甘油醛-3-磷酸脫氫酶失活，進一步增加SH-SY5Y細胞內(nèi)GA濃度，導(dǎo)致GA-AGEs產(chǎn)生和神經(jīng)細胞毒性增強[6]。

1.1.5硅膠納米粒子 硅膠納米粒子(silica nanoparticles，SiNPs)是工業(yè)中最廣泛使用的納米粒子之一，并且已經(jīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞和非病毒基因的遞送。研究表明，SiNPs具有神經(jīng)毒性，可誘導(dǎo)SK-N-SH和N2a細胞凋亡，并提高細胞內(nèi)ROS水平；另外，經(jīng)SiNPs處理的細胞內(nèi)Aβ1-42沉積增加和Tau蛋白Ser262和Ser396磷酸化[7]。

1.2 氧化應(yīng)激損傷

1.2.1過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2) H2O2是一種強氧化劑，可誘導(dǎo)體外細胞產(chǎn)生ROS，抑制細胞增殖，并氧化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等細胞內(nèi)大分子，產(chǎn)生過量的脂質(zhì)氧化物及自由基等，導(dǎo)致組織損傷和細胞死亡。此外，研究顯示H2O2可通過c-Jun N-末端激酶誘導(dǎo)β-分泌酶的啟動子活性，導(dǎo)致APP表達增加和Aβ積聚[8]，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。

1.2.2晚期糖基化終末產(chǎn)物 晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)主要是由蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖的醛基經(jīng)過非酶促糖基化反應(yīng)產(chǎn)生不可逆的終末產(chǎn)物。AGEs積累后能誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生大量ROS，從而引發(fā)氧化損傷；同時，高水平的AGEs和ROS將導(dǎo)致AGEs受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)過表達[9]。AGEs與其受體RAGE結(jié)合是其致病的主要途徑，兩者相結(jié)合后，通過激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶產(chǎn)生ROS，增強機體氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[9]。此外，AGEs累積也與炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等機制相關(guān)。

1.3 Tau蛋白過度磷酸化大量研究證明，Tau蛋白過度磷酸化在AD疾病中起著重要作用。岡田酸(okadaic acid，OA)是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化。體外研究表明[10]，經(jīng)OA處理的神經(jīng)細胞，Tau蛋白Ser-262位點磷酸化水平明顯升高；同時，OA具有神經(jīng)毒性，引起神經(jīng)元細胞突觸損傷。因此，OA可用于制備Tau蛋白過度磷酸化的AD細胞模型。

2 細胞模型的建立及評價指標

2.1 人神經(jīng)母細胞瘤細胞人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK-N-SH和SH-SY5Y常用于研究AD發(fā)病機制。SK-N-SH細胞系來源于一名4歲女性的轉(zhuǎn)移性神經(jīng)母細胞瘤的骨髓活檢組織，該細胞系在體外培養(yǎng)狀態(tài)下的生長特性類似神經(jīng)元，具有神經(jīng)元酶表達的多能性，如多巴胺-β-羥化酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶[11]。同時，研究表明SK-N-SH細胞經(jīng)10 μmol·L-1全反式維甲酸誘導(dǎo)分化后細胞突觸明顯伸長、突觸素表達明顯升高等典型的神經(jīng)元特征[10]。而SH-SY5Y細胞系應(yīng)用最為廣泛，是SK-N-SH細胞系的一個亞系，并經(jīng)歷3次克隆選擇產(chǎn)生(SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y)[11]。該細胞系表現(xiàn)出多巴胺能神經(jīng)元的特性，可表征多巴胺能標志物，如：多巴胺-β-羥化酶、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白，具有合成和降解多巴胺的能力；同時，該細胞經(jīng)誘導(dǎo)劑維甲酸誘導(dǎo)分化后，引起多巴胺能神經(jīng)元特征加強，具有高表達的囊泡單胺轉(zhuǎn)運體1(vesicular monoamine transporter1，SLC18A1)、多巴胺受體D2(dopamine receptorD2，DRD2)[12]。

目前，常用于誘導(dǎo)人神經(jīng)母細胞瘤細胞建立AD模型的造模試劑包括：Aβ、H2O2、AGEs、GA、OA、SiNPs等，其誘導(dǎo)時間大多為24 h或48 h。檢測指標主要有細胞活力、凋亡率及相關(guān)凋亡蛋白表達、氧化應(yīng)激相關(guān)指標、Tau蛋白磷酸化水平等，具體詳情見Tab 1。因此，該類細胞模型主要體現(xiàn)AD疾病的細胞凋亡、氧化應(yīng)激、Tau蛋白磷酸化等病理特征。

2.2 NG108-15細胞株NG108-15細胞株是由小鼠神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma)和大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)細胞雜交形成的神經(jīng)腫瘤細胞。Tojima等[13]發(fā)現(xiàn)該細胞株經(jīng)分化劑丁酰環(huán)磷酸腺苷(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate，db-cAMP)刺激分化后，表現(xiàn)出神經(jīng)元樣形態(tài)，具有神經(jīng)突結(jié)構(gòu)；同時，通過比較研究發(fā)現(xiàn)未分化和分化的NG108-15細胞株均能不同程度表達神經(jīng)元蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)蛋白，但未分化的細胞僅能表達神經(jīng)膠質(zhì)蛋白，如波形蛋白，而極少表達神經(jīng)元蛋白，如神經(jīng)絲蛋白(neurofilament，NF)200、磷酸化NF200，因此認為未分化的NG108-15細胞株不是神經(jīng)元樣細胞；此外，分化后的NG108-15細胞株也能表達ChAT蛋白，揭示該細胞能合成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿。

NG108-15細胞株常應(yīng)用于AD等與認知、記憶相關(guān)的體外研究。研究常采用Aβ25-35[14]、OA[15]等誘導(dǎo)NG108-15細胞株，其模型主要機制涉及細胞凋亡、Tau蛋白異常磷酸化等，與AD病人腦組織中的病理特征一致，可作為研究AD的細胞模型。具體造模方法見Tab 1。

2.3 小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞克隆的小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞(mouse neuroblastoma cells，N2a/Neuro-2a)是從A株白化鼠的自發(fā)性腫瘤而建立，該腫瘤系被命名為C1300。該細胞多數(shù)呈神經(jīng)元樣，具有軸突樣結(jié)構(gòu)，部分細胞間可見突起交織成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。研究顯示N2a細胞表達核受體相關(guān)因子1并產(chǎn)生低水平的TH和多巴胺；但經(jīng)0.5 mmol·L-1db-cAMP處理后，N2a細胞中TH和多巴胺水平均顯著增強，從而促進多巴胺能神經(jīng)元的形成[16]。

目前，N2a細胞作為體外研究AD發(fā)病機制的常見細胞模型。研究常采用Glu、FA、SiNPs等物質(zhì)誘導(dǎo)N2a細胞建立AD模型，其模型的誘導(dǎo)物質(zhì)處理時間大多為24 h。N2a細胞經(jīng)造模試劑誘導(dǎo)后常出現(xiàn)Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化、氧化損傷、細胞凋亡等AD樣的病理學特征[4-5,7]。具體造模方法見Tab 1。

2.4 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系(rat phcochromocytoma cell，PC12)來源大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤，是一種研究神經(jīng)細胞生理、病理及藥理的理想細胞。該細胞具有一定的神經(jīng)內(nèi)分泌屬性，其細胞能合成多巴胺及去甲腎上腺素等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，并儲存于細胞囊泡中通過胞吐作用釋放[17]。同時，PC12細胞膜上具有神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)受體，經(jīng)NGF誘導(dǎo)刺激后可轉(zhuǎn)化為具有神經(jīng)元特性的神經(jīng)元樣細胞，如：PC12細胞突起明顯延長、交織，呈現(xiàn)典型神經(jīng)元形態(tài)；細胞抗神經(jīng)元分化標志微管相關(guān)蛋白(microtubule associated protein，MAP)2染色呈強陽性[18]。

PC12細胞常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。學者常采用Aβ25-35[19]、Glu[4]、H2O2[9]等誘導(dǎo)PC12細胞建立AD細胞模型，其藥物處理時間為24 h或48 h。PC12細胞經(jīng)造模試劑誘導(dǎo)后主要涉及氧化損傷、細胞凋亡等方面。具體造模方法見Tab 1。

2.5 小鼠海馬神經(jīng)元細胞系小鼠海馬神經(jīng)元細胞系(hippocampal neuronal cell line，HT22)是HT4細胞的亞系，HT4細胞是用溫度敏感的SV40病毒為抗原篩選出來的永生化的神經(jīng)細胞，來源于小鼠海馬神經(jīng)元組織[20]。該細胞系具有膽堿能神經(jīng)元特性，研究發(fā)現(xiàn)未分化的HT22細胞也表達了一些膽堿能標志物，如ChAT、膽堿轉(zhuǎn)運蛋白、囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運蛋白和毒蕈堿乙酰膽堿受體，但分化的HT22細胞在形態(tài)學和神經(jīng)化學水平上更類似于膽堿能神經(jīng)元；同時，分化的HT22細胞具有明顯的神經(jīng)突生長，形態(tài)上與神經(jīng)元細胞相似[21]。故研究宜選用分化的HT22細胞建立AD細胞模型。Aβ25-35、Glu、OA常用于誘導(dǎo)HT22細胞系建立細胞凋亡模型，其機制可能與氧化應(yīng)激、細胞凋亡有關(guān)。具體造模方法見Tab 1。

Tab 1 Establishment of AD cellular models and evaluation indicators

Tab 2 Characteristics of AD modeling cells before and after differentiation

3 總結(jié)

綜上，AD細胞模型是目前研究神經(jīng)生物學及神經(jīng)藥理學的重要方法，具有來源豐富、干擾因素小、實驗條件易控制且評價機制靈活等特點。AD細胞模型可供選擇的造模試劑和細胞株種類較多，其造模試劑依據(jù)誘導(dǎo)機制的不同分為神經(jīng)毒性損傷、氧化應(yīng)激損傷及Tau蛋白過度磷酸化，包括：Aβ、Glu、FA、H2O2等；細胞主要包括人神經(jīng)母細胞瘤細胞、NG108-15細胞、N2a細胞、PC12細胞等。各細胞來源不同，其常規(guī)培養(yǎng)基主要采用DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640及DMEM/F12。查閱大量文獻研究發(fā)現(xiàn)，該類細胞模型主要研究以下機制：(一)細胞調(diào)亡，檢測其調(diào)亡蛋白、凋亡率；(二)細胞氧化應(yīng)激損傷，檢測細胞ROS、GSH、GSH-Px、MDA以及其它氧化指標；(三)炎性反應(yīng)，檢測細胞炎癥因子，如TNF-α。

筆者認為，學者可根據(jù)研究基礎(chǔ)和目的，選擇適宜的細胞株和造模試劑建立AD細胞模型。研究常采用Aβ、Glu、H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y和PC12細胞建立AD細胞模型，揭示AD的細胞凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷等機制。另外，也采用OA誘導(dǎo)細胞模擬AD的Tau蛋白磷酸化機制。目前，未分化和分化的細胞均已用于AD的體外實驗。研究發(fā)現(xiàn)NG108-15細胞經(jīng)分化劑分化后表達神經(jīng)元蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)蛋白等神經(jīng)元特性，此外大部分細胞經(jīng)分化劑分化后神經(jīng)元特性表達進一步增強，如：SK-N-SH細胞突觸伸長；N2a細胞多巴胺能神經(jīng)元特性增強，具體見Tab 2。因此，當確定是否應(yīng)將未分化細胞或分化細胞用于特定實驗時，應(yīng)考慮上述性質(zhì)。筆者認為分化后細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特點及功能特征更接近神經(jīng)元。同時，分化后的細胞生長更容易培養(yǎng)，如：PC12細胞在分化前貼壁性較差，聚集成團狀，呈半漂浮狀態(tài)，且細胞形態(tài)易發(fā)生改變；而分化后細胞完全貼壁而不聚集成團狀。因此，筆者推薦采用分化后的該類細胞用于研究AD。

此外，基因工程技術(shù)也可用于AD細胞模型的構(gòu)建。目前，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染細胞應(yīng)用廣泛，在一定程度上提高了細胞病理表達的準確性。如人胚腎上皮細胞(HEK293)是一種可表達外源基因的細胞株，常用于轉(zhuǎn)染試驗，具有容易轉(zhuǎn)染和容易培養(yǎng)的特點。另外，學者通過APP595/596質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞建立APP高表達的AD細胞模型，轉(zhuǎn)染后檢測到細胞內(nèi)APP和Aβ的表達均增加[24]。筆者認為將來可基于分子生物學、分子細胞生物學、基因工程等新技術(shù)綜合構(gòu)建能快速轉(zhuǎn)染，又最大限度完善表達神經(jīng)元的生理特點，并能長期穩(wěn)定生長及培養(yǎng)的細胞模型。除基因轉(zhuǎn)染技術(shù)外，誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技術(shù)也發(fā)展迅速。研究發(fā)現(xiàn)iPSCs也用于AD細胞模型的建立，Shi等[25]從AD患者體細胞重新編程產(chǎn)生iPSCs，經(jīng)分化后獲得的神經(jīng)元表征出了Aβ以及Tau蛋白過度磷酸化等AD早期病理特征；同時，研究發(fā)現(xiàn)干細胞也可用于治療AD或延遲其疾病的發(fā)生。

基于所述，目前應(yīng)用體外構(gòu)建AD細胞模型的方法較為廣泛，但仍有部分問題亟待解決，如：細胞培養(yǎng)過程中各種代謝中間體、離子、血清成分和底物如何影響細胞的生長和分化有待進一步研究；AD細胞模型目前僅采用單一因素誘導(dǎo)細胞，不符合AD病因及病機的復(fù)雜性；尚缺乏與臨床微觀病理特點完全契合的細胞模型建立方法和統(tǒng)一的模型標準評價體系。因此，筆者認為學者在進一步深入研究中應(yīng)優(yōu)化現(xiàn)有AD細胞模型建模方法，系統(tǒng)地引入多維度、多致病因素復(fù)合的AD細胞模型構(gòu)建方法，以期為模型標準化評價及基于神經(jīng)細胞靶向治療AD的有效途徑以及策略提供思路與借鑒。