疏血通注射液對(duì)缺氧缺糖后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)谷氨酸清除的影響

殷孟蘭，徐 耀，袁 慶，牛文興，王少峽，胡利民，柴麗娟

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院、天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301600)

腦血管閉塞后，神經(jīng)元突觸前膜釋放的谷氨酸無法很快的被突觸后膜轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致在神經(jīng)元外部的谷氨酸大量聚集[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(excitatory amino acid transporters 2，EAAT2)清除過量的谷氨酸[2]。有研究表明，EAAT2在急性缺血性腦中風(fēng)時(shí)的表達(dá)大量減少，而增加EAAT2的表達(dá)可對(duì)神經(jīng)產(chǎn)生保護(hù)作用[3]。疏血通注射液以水蛭和地龍為主要成分[4]，早期的研究顯示，疏血通對(duì)損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞有保護(hù)作用[5]，但疏血通注射液是否能通過提高損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)胞外谷氨酸攝取來減輕神經(jīng)損傷的作用未見研究，本實(shí)驗(yàn)就此展開研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑出生1～2 d Wistar大鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SPF級(jí)，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006；疏血通注射液(廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025652)；單體(1504，MW：1103.3，氨基酸序列：VAPEEHPVLL、1505，MW：1349.5，氨基酸序列：FAGDDAPRAVFPS、1506，MW：1259.5，氨基酸序列：RVAPEEHPVLL)；谷氨酰胺、dBcAMP、Glutamate Assay Kit(美國(guó)Gibco公司)；谷氨酸試劑盒(Sigma，美國(guó))；Anti-GFAP(CST，Danvers，MA)；Cell Counting Kit-8(同仁，日本)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(索萊寶，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]并根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行相應(yīng)改動(dòng)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光法鑒定，并每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.2.2細(xì)胞分組與處理 對(duì)照組采用正常全培培養(yǎng)；模型組缺氧時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)液為EBSS溶液，放入缺氧小室于37 ℃條件下缺氧培養(yǎng)3 h，復(fù)氧時(shí)重新?lián)Q為全培溶液繼續(xù)培養(yǎng)3 h；給藥組于全培中加入0.0625 mmol·L-1的dBcAMP和不同稀釋比例的疏血通注射液或單體因子，缺氧3 h，復(fù)氧時(shí)將上清更換為含100 μmol·L-1高濃度谷氨酸的加藥全培溶液繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 分組處理如“1.2.2”所述，復(fù)氧結(jié)束后更換細(xì)胞上清為10% CCK-8溶液(100 μL/孔)，37 ℃避光孵育30 min，450 nm檢測(cè)吸光度值。

1.2.4測(cè)定谷氨酸濃度 星型膠質(zhì)細(xì)胞于高濃度谷氨酸培養(yǎng)(100 μmol·L-1)3 h后，每孔取50 μL上清至培養(yǎng)板中，加入反應(yīng)液100 μL/孔，混勻后于37 ℃搖床孵育30 min，450 nm檢測(cè)吸光度；裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度已對(duì)谷氨酸濃度進(jìn)行校正。

1.2.5蛋白免疫印跡法測(cè)定EAAT2的蛋白表達(dá) 蛋白樣品經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，加入配置好的EAAT2 Rabbit(1 ∶1 000)及 β-actin(1 ∶1000)一抗于4 ℃滾軸過夜；次日TBST洗滌3次，加入IgG-HRP二抗(1 ∶10 000)，最后使用Amersham Imager 600多功能成像儀顯影。

2 結(jié)果

2.1 疏血通注射液對(duì)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響如Tab 1所示，與對(duì)照組比較，Hypo/Reox組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)；與Hypo/Reox組相比，疏血通不同濃度組以及單體成分1504、1505、1506均能顯著提高缺氧復(fù)氧損傷后星形膠質(zhì)活力(P<0.01)。

2.2 疏血通注射液對(duì)胞外谷氨酸的清除能力的影響如Tab 1所示，與對(duì)照組比較，Hypo/Reox組培養(yǎng)液中谷氨酸濃度顯著升高(P<0.01)，提示損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸清除能力明顯降低；與Hypo/Reox組比較，疏血通注射液中劑量組、低劑量組和單體因子1505組培養(yǎng)液中谷氨酸濃度顯著降低(P<0.01)，提示其能明顯改善受損星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)胞外高濃度的谷氨酸的清除能力。

2.3 疏血通注射液對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞上EAAT2蛋白表達(dá)的影響如Tab 1所示，與對(duì)照組比較，Hypo/Reox組EAAT2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與Hypo/Reox組相比，疏血通注射液低、中劑量組和單體因子1505組EAAT2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，表明疏血通注射液和單體因子1505對(duì)缺血缺氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的影響。

Tab 1 Effect of Shuxuetong Injection on activity of damaged astrocytes, extracellular glutamate clearance and

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vshypo/Reox

3 討論

谷氨酸作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，主要由神經(jīng)元釋放，能通過與神經(jīng)元突觸后膜受體結(jié)合，維持正常神經(jīng)系統(tǒng)功能[7]；但谷氨酸也具有潛在的興奮毒性，腦缺血后谷氨酸的大量聚集會(huì)加劇神經(jīng)細(xì)胞的死亡[8]。因此，增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取尤為重要。本研究結(jié)果表明，疏血通注射液可明顯升高EAAT2的表達(dá)，降低細(xì)胞外谷氨酸濃度，提示疏血通注射液可以增加缺氧缺糖后星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于胞外高濃度谷氨酸的攝取能力，可能發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用，且單體因子1505(MW：1349.5，氨基酸序列：FAGDDAPRAVFPS)對(duì)谷氨酸同樣具有較明顯的清除作用，可能為疏血通注射液發(fā)揮谷氨酸清除作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。