何映華 何熒 周玲艷 潘偉明

摘 要：本研究以發(fā)芽4d，生長(zhǎng)狀況良好，高約4cm的菜心無(wú)菌苗為材料，初步研究了菜心幼苗不同部位材料、滲透（甘露醇）濃度、酶解時(shí)間、果膠酶、纖維素酶濃度等關(guān)鍵因素對(duì)原生質(zhì)體游離的影響。結(jié)果表明，從菜心幼苗的幼葉組織分離原生質(zhì)體效果比下胚軸好;以w=1.5%的纖維素和w=0.4%的果膠酶為酶解液，在0.8mol/L甘露醇濃度下，40～50r/min的搖床中黑暗酶解4h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量是最高的。

關(guān)鍵詞：菜心;外植體;原生質(zhì)游離;條件優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200415005

收稿日期：2020-03-05

基金項(xiàng)目：廣東省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：何映華（1995-），女，本科在讀。研究方向：生物技術(shù);通訊作者潘偉明（1969-），男，碩士，研究員。研究方向：植物遺傳育種。

菜心（Brassica campestris var. Parachinesis）是十字花科蕓薹屬中以菜薹為產(chǎn)品的一種蔬菜，是華南地區(qū)栽培規(guī)模最大的特產(chǎn)蔬菜之一，在華南地區(qū)的蔬菜周年供應(yīng)及出口創(chuàng)匯中起著舉足輕重的作用[1]。每年4—9月份是廣東省高溫多雨的季節(jié)，菜心露地栽培難度大，病蟲(chóng)多發(fā)、產(chǎn)量低、品質(zhì)差[2]。這大大限制了菜心產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，因此迫切需要選育適合華南地區(qū)條件生長(zhǎng)、抗逆性佳的優(yōu)良品種。

原生質(zhì)體由于沒(méi)有細(xì)胞壁，在物理、化學(xué)因素誘導(dǎo)下，2個(gè)互相靠近的原生質(zhì)體可發(fā)生融合，可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，從而獲得雜種株系，服務(wù)于作物改良[3]。植物原生質(zhì)體與植物細(xì)胞一樣具有全能性，而且可以直接導(dǎo)入外源DNA、細(xì)胞器等。因此可以導(dǎo)入特定的基因，從而達(dá)到改良作物的品質(zhì)、抗逆性等目的，是植物遺傳轉(zhuǎn)化不可多得的理想受體[3-5]。同時(shí)，原生質(zhì)體也是獲得細(xì)胞無(wú)性突變系的優(yōu)良材料[6]，可通過(guò)定向選擇篩選出特異性的變異體。因此，原生質(zhì)體是實(shí)現(xiàn)新品種選育的理想材料。

1980年，麥鶴云等[7]進(jìn)行了菜心原生質(zhì)體分離方法的初步探討，發(fā)現(xiàn)菜心葉肉組織在滲透壓0.7M（甘露醇），酶液濃度為1%，處理2h時(shí)效果較好，90%分離出原生質(zhì)體。1994年，張?zhí)m英等[8]以菜心下胚軸為材料，2%纖維素酶R-10、1%果膠酶R-10、0.5%崩潰酶，25℃黑暗條件下靜置3h，再30r/min震蕩處理14h游離原生質(zhì)體，并培養(yǎng)獲得植株再生。

2003年，F(xiàn)an等[9]以菜心花粉粒為材料，1%纖維素酶R-10、0.08%果膠酶Y-23，28℃游離1h獲得原生質(zhì)體。體細(xì)胞雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用于蕓薹屬植物中，可以有效克服有性雜交不親和性及雌/雄性不育等常規(guī)育種所遇到的問(wèn)題。同時(shí)，體細(xì)胞雜交能實(shí)現(xiàn)核基因性狀及細(xì)胞質(zhì)基因性狀的轉(zhuǎn)移重組[10]。

適宜的材料是獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體的前提條件，蕓薹屬植物用于分離原生質(zhì)體的材料來(lái)源主要有無(wú)菌苗的子葉、下胚軸、真葉。酶也是影響植物原生質(zhì)體分離的關(guān)鍵因素之一，不同的植物種類(lèi)和外植體材料所用的酶液組合和濃度不同。此外，酶液的滲透壓對(duì)原生質(zhì)體的分離也至關(guān)重要，適宜濃度的滲透壓可維持細(xì)胞內(nèi)外的壓力，對(duì)原生質(zhì)體起到保護(hù)作用[10]。本研究以“美綠菜心”品種為實(shí)驗(yàn)材料，比較了供試材料、酶液濃度、酶解時(shí)間以及滲透壓等條件游離原生質(zhì)體的效果，以期獲得菜心原生質(zhì)體游離的最佳條件，從而為菜心體細(xì)胞雜交和品種資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?無(wú)菌苗的獲得

實(shí)驗(yàn)材料為“美綠菜心”品種。篩選飽滿一致的種子，在超凈臺(tái)內(nèi)，用75%乙醇消毒30s，0.1%L汞浸泡8min，無(wú)菌水沖洗3次，然后用無(wú)菌濾紙吸干水分，接種于1/2MS培養(yǎng)基中，每瓶接種40粒，置于25℃，12h/d黑暗條件下進(jìn)行種子萌發(fā)、生長(zhǎng)，獲得無(wú)菌苗。取苗齡3～4d，高約4cm的無(wú)菌苗下胚軸和幼葉作為原生質(zhì)體游離的材料。

1.2?酶液的準(zhǔn)備

CPW的配制：KH2PO4 27.2mg/L、KNO3 101mg/L、KI 0.16mg/L、CaCl2·2H2O 1480mg/L、MgSO4·7H2O 240mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MES5moL/L、甘露醇0.5～0.9moL/L，以1moL/LHCl調(diào)整pH至5.6。

酶液的配制：以CPW溶液為溶劑，稱取一定質(zhì)量的纖維素酶R-10和果膠酶Y-23，充分溶解后，以細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾滅菌，以用于原生質(zhì)體的游離。

1.3?原生質(zhì)體的游離

稱取1g葉片或靠子葉端1cm長(zhǎng)的下胚軸，用手術(shù)刀片將葉片切割成寬0.5mm的細(xì)條，下胚軸橫切成0.3～0.4mm厚的薄片。將切割好的材料加入到10mL酶解液中，然后置于搖床上輕輕振蕩（50rpm/min），黑暗條件下進(jìn)行原生質(zhì)體游離。

1.3.1?不同材料的選擇

分別以無(wú)菌苗的幼嫩子葉和下胚軸為材料，酶液濃度、酶解時(shí)間、滲透壓濃度等條件一致，比較不同材料菜心原生質(zhì)體游離的效果。

1.3.2?纖維素酶濃度設(shè)置

以無(wú)菌苗幼嫩子葉為材料，果膠酶濃度0.4%，甘露醇濃度0.7moL/L，游離時(shí)間4h，設(shè)置纖維素酶濃度為1.0、1.5、2.0和2.5%，以確定合適的纖維素酶濃度。

1.3.3?果膠酶濃度設(shè)置

以無(wú)菌苗幼嫩子葉為材料，纖維素酶濃度1.0%，甘露醇濃度0.7moL/L，游離時(shí)間4h，設(shè)置果膠酶濃度為0.1%、0.2%、0.4%和0.6%，以確定合適的果膠酶濃度。

1.3.4?滲透濃度設(shè)置

以無(wú)菌苗幼嫩子葉為材料，纖維素酶濃度1.0%，果膠酶濃度0.4%，游離時(shí)間4h，設(shè)置甘露醇濃度為0.5moL/L、0.6moL/L、0.7moL/L、0.8moL/L和0.9moL/L，以確定合適的滲透濃度。

1.3.5?酶解時(shí)間設(shè)置

以無(wú)菌苗幼嫩子葉為材料，纖維素酶濃度1.0%，果膠酶濃度0.4%，甘露醇濃度0.7moL/L，設(shè)置酶解時(shí)間為2h、3h、4h、5h、6h和7h，以確定最合適的游離時(shí)間。

1.4?原生質(zhì)體的純化與計(jì)數(shù)

酶液中充分離解的原生質(zhì)體，用45μm孔徑的不銹鋼篩過(guò)濾，濾液通過(guò)800r/min離心5min，收集原生質(zhì)體，棄去上清，沉淀以CPW洗滌2次，得到純的原生質(zhì)體，并以CPW重懸原生質(zhì)體，取0.1mL懸浮液滴加在血球計(jì)數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)5個(gè)重復(fù)，最后計(jì)算出每克鮮重材料的原生質(zhì)體數(shù)量。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同材料對(duì)菜心原生質(zhì)體游離的影響

本實(shí)驗(yàn)分別以菜心幼嫩子葉和下胚軸為材料進(jìn)行原生質(zhì)體游離。結(jié)果表明，菜心幼嫩子葉分離原生質(zhì)體的得率5.46×106個(gè)/g·FW，而以下胚軸為材料幾乎沒(méi)有游離出原生質(zhì)體。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以菜心幼苗幼嫩葉片為材料。

2.2?酶液濃度菜心原生質(zhì)體游離的影響

纖維素酶和果膠酶濃度對(duì)菜心原生質(zhì)體游離的影響如表1。結(jié)果表明，不同濃度的纖維素酶和果膠酶對(duì)菜心原生質(zhì)體產(chǎn)量有比較大的影響。對(duì)于纖維素酶來(lái)說(shuō)，在一定的濃度范圍內(nèi)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著纖維素酶濃度的增加而增加，當(dāng)纖維素酶濃度為1.5%時(shí)，菜心原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為13.5×106個(gè)/g·FW;當(dāng)纖維素酶濃度繼續(xù)增大時(shí)，菜心原生質(zhì)體產(chǎn)量有所下降。對(duì)于果膠酶來(lái)說(shuō)，同樣是在一定的濃度范圍內(nèi)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著果膠酶濃度的增加而增加，當(dāng)果膠酶濃度為0.4%時(shí)，菜心原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為12.5×106個(gè)/g·FW;當(dāng)果膠酶濃度繼續(xù)增大，達(dá)到0.6%時(shí)，菜心原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯下降，且明顯低于果膠酶0.1%時(shí)的原生質(zhì)體產(chǎn)量。且隨著果膠酶濃度的上升，原生質(zhì)體開(kāi)始大量出現(xiàn)不規(guī)則的形狀，原生質(zhì)體懸浮液中有較多的細(xì)胞碎片。綜上所述，“美綠菜心”原生質(zhì)體游離最合適的纖維素酶和果膠酶濃度分別為1.5%和0.4%。

2.3?甘露醇濃度對(duì)菜心原生質(zhì)體游離的影響

甘露醇對(duì)菜心原生質(zhì)體游離的影響如表2。結(jié)果表明，滲透濃度對(duì)菜心原生質(zhì)體的產(chǎn)量有明顯影響，在一定的濃度范圍內(nèi)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著甘露醇濃度的增加而增加，當(dāng)甘露醇濃度為0.5moL/L時(shí)，菜心原生質(zhì)體的產(chǎn)量為11.5×106個(gè)/g·FW，且原生質(zhì)體破裂情況嚴(yán)重，懸浮液中細(xì)胞碎片較多;當(dāng)滲透濃度是0.8moL/L時(shí)，菜心原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，且與甘露醇濃度為0.5moL/L和0.9moL/L時(shí)達(dá)顯著差異。當(dāng)甘露醇濃度為0.9moL/L時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，但原生質(zhì)體形狀、大小一致性好，破碎原生質(zhì)體少。綜上所述，“美綠菜心”原生質(zhì)體分離最適宜甘露醇濃度為0.8moL/L。

2.4?酶解時(shí)間對(duì)菜心原生質(zhì)體游離的影響

酶解時(shí)間對(duì)菜心原生質(zhì)體游離的影響如表3。結(jié)果表明，在一定的游離時(shí)間范圍內(nèi)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解時(shí)間的增加而增加，當(dāng)原生質(zhì)體游離時(shí)間為2h時(shí)，菜心原生質(zhì)體游離產(chǎn)量為7.0×106個(gè)/g·FW，而游離時(shí)間達(dá)到4h時(shí)，菜心原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高，為11.5×106個(gè)/g·FW，與游離時(shí)間為2h達(dá)到顯著差異。隨著游離時(shí)間的進(jìn)一步增加，菜心原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯下降，表現(xiàn)為原生質(zhì)體開(kāi)始大量破裂，懸浮液中細(xì)胞碎片明顯增多。綜上所述，菜心原生質(zhì)體游離最佳酶解時(shí)間為4h。

3?討論

適宜的植物材料是分離高質(zhì)量原生質(zhì)體的前提條件，生長(zhǎng)旺盛的組織有利于獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量。用于分離蕓薹屬植物的材料來(lái)源主要有無(wú)菌苗的子葉、下胚軸、真葉[10]。下胚軸往往被認(rèn)為是蕓薹屬植物原生質(zhì)體分離效果較好的材料來(lái)源[11，12]。但孫慧慧[13]以甘藍(lán)型油菜品種（系）中“雙6號(hào)”下胚軸、子葉和葉片為材料，發(fā)現(xiàn)子葉和真葉的原生質(zhì)體產(chǎn)量比下胚軸高。張?zhí)m英等[8]以發(fā)芽4d，高約3～4cm的菜心無(wú)菌苗下胚軸進(jìn)行17h的游離獲得一定數(shù)量的原生質(zhì)體，并通過(guò)培養(yǎng)獲得再生植株。本實(shí)驗(yàn)比較了葉片和下胚軸的游離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以下胚軸為材料游離4h時(shí)，在顯微鏡下幾乎觀察不到原生質(zhì)體，而幼嫩葉片的游離效果較好，這與張?zhí)m英等[8]的結(jié)果有一定的出入，可能是其在實(shí)驗(yàn)中撕去了下胚軸的表皮，另外使用了崩潰酶（0.5%）和較高濃度的果膠酶濃度（1%），有利于細(xì)胞離解而提高了原生質(zhì)體的游離效果。麥鶴云等[7]以菜心葉肉組織為材料，以1%酶濃度游離1.5～2h獲得90%的游離效果，說(shuō)明葉片是菜心原生質(zhì)體比較好的材料。

酶是影響植物原生質(zhì)體分離效果的關(guān)鍵因素之一。常用的主要有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、崩潰酶和離析酶等，纖維素酶使用濃度為1%～2%，果膠酶使用濃度為0.5%～1.0%，酶解時(shí)間也從幾小時(shí)到十幾小時(shí)不等。不同的植物種類(lèi)和外植體材料所用的酶液組合和濃度也有差異[14，15]。李貴等[16]以結(jié)球甘藍(lán)的無(wú)菌苗下胚軸為材料進(jìn)行原生質(zhì)體游離時(shí)發(fā)現(xiàn)，2.5%纖維素酶和0.05%果膠酶組合，酶解時(shí)間為16h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力為最高。范春麗等[17]以甘藍(lán)型黃籽油菜子葉和下胚軸為材料進(jìn)行原生質(zhì)體游離時(shí)發(fā)現(xiàn)，1%纖維素酶和0.5%離析酶酶液組合下，其原生質(zhì)體分離效果最好。本實(shí)驗(yàn)中，菜心原生質(zhì)體最合適的酶濃度是1.5%纖維素酶R-10和0.4%果膠酶Y-23。一般植物原生質(zhì)體游離的酶解時(shí)間在24h以內(nèi)，酶解時(shí)間過(guò)短或者過(guò)長(zhǎng)都會(huì)影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量和質(zhì)量。如，草莓原生質(zhì)體酶解14h時(shí)獲得的產(chǎn)量最高，當(dāng)延長(zhǎng)至18h時(shí)，其得率比14h時(shí)減少了近40%[14]。本實(shí)驗(yàn)酶解時(shí)間為4h時(shí)效果最佳，隨酶解時(shí)間增長(zhǎng)，酶解液中原生質(zhì)體形狀開(kāi)始出現(xiàn)不規(guī)則，細(xì)胞開(kāi)始破碎，產(chǎn)量下降。張?zhí)m英等[8]和麥鶴云等[7]分別以菜心的下胚軸和葉肉組織為材料分離原生質(zhì)體所使用的酶液組織種類(lèi)和濃度以及獲得一定數(shù)量原生質(zhì)體所需酶解時(shí)間也不一樣。

酶解滲透壓對(duì)原生質(zhì)體的分離也至關(guān)重要，適宜濃度的滲透壓可維持細(xì)胞內(nèi)外的壓力，對(duì)原生質(zhì)體起保護(hù)作用。滲透壓穩(wěn)定劑主要有甘露醇、山梨醇、葡萄糖等，但以甘露醇最為常用，濃度一般在0.4～0.8mol/L之間[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)滲透液濃度為0.8mol/L時(shí)效果最好。

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（責(zé)任編輯?周康）