產吲哚乙酸（IAA）促生菌的分離鑒定及對煙草種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的影響

陳 越 李虎林 朱詩苗 閆 寒 郎 彬 姬文秀

（延邊大學農學院，133002，吉林延吉）

吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是植物生長素的一種，是植物生長過程中分泌的調節(jié)植物生長的信號物質[1]，能促進細胞生長，使細胞的體積和質量增加，還具有促進細胞分裂和分化、調節(jié)生根等生理功能[2]。研究發(fā)現，在土壤中約有一半的細菌能夠合成IAA[3]，而這些細菌常見于植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizabacteria，PGPR）。PGPR泛指生存于植物根際土壤或定植于植物根表、根內的一類對植物生長有益的微生物[4]，可通過固氮、溶磷解鉀、產生植物激素等途徑促進植物生長[5]。徐立國等[6]研究發(fā)現，菌株3183貝萊斯茅芽孢桿菌（Bacillus velezensis）具有高產IAA能力，用其澆灌后的煙草地上部和地下部鮮重均高于對照。邢芳芳等[7]研究表明，菌株HB-1枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有較好的IAA生產能力，且對白菜生長具有明顯促進作用。汪錢龍等[8]研究結果顯示，菌株C-3解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）生長素分泌能力最強，可明顯提高玉米鮮重、干重、株高等農藝性狀指標。有報道稱，促生菌Variovorax boronicumulansCGMCC 4969具有被寄主植物用來調節(jié)IAA水平的潛力[9]。此外，優(yōu)化微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件，可使菌株獲得最大量的目標代謝產物。王呈玉等[10]優(yōu)化XSF巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）促生菌劑發(fā)酵工藝條件，使其活菌數達到2.56×1010cfu/g。王勇等[11]優(yōu)化促生菌株Bacillus amyloliquefaciensGZ-5發(fā)酵條件后，其菌體生物量及芽孢生成量均達到最佳。因此，對具有分泌IAA能力的植物根際促生菌的研究逐步成為微生物肥料研究的熱點，而篩選具有產生IAA的微生物可為促生生物肥料的研發(fā)等提供菌株。

延邊大學農學院植物生理生化實驗室前期已對延邊不同煙區(qū)、不同煙草品種內生及根際細菌群落進行了全面的分析，獲得了多種原位細菌資源[12]。本試驗擬進一步分離篩選具有產IAA能力的促生菌株，明確其分類地位，并采用液體搖瓶發(fā)酵單因素試驗優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，研究單細菌及混合菌劑對煙草種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的影響，以期為煙草促生生物菌劑的開發(fā)及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 延邊地區(qū)煙草根際土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 LB肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用于菌株液體培養(yǎng)；LA培養(yǎng)基：酵母膏5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、瓊脂粉15g，用于菌株固體培養(yǎng)；Salkowski試劑：35%高氯酸500mL、0.5mol/L FeCl310mL（現用現配）；其他試劑：1% CuSO4、0.5% ZnSO4、L-色氨酸、標準吲哚乙酸（IAA），以上生化試劑均為分析純。細菌DNA提取及擴增試劑均為分析純，Taq酶、dNTP、Buffer Mg(-)、MgCl2等購自寶生物工程（大連）有限公司。細菌通用引物27f和1492r由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 煙草種子 供試煙草品種為吉煙9號，由延邊州農業(yè)科學研究院煙草研究所提供種子。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離 于2017年6月在吉林省延邊煙草種植區(qū)采集樣本，采用五點取樣法選取健康煙株，輕輕抖落附著的土壤，截取煙株根部放置于自封袋中，裝入冰盒迅速帶回實驗室。小心取出煙根，將其置于500mL容量瓶中，加入200mL磷酸鹽緩沖液（pH=7.8），恒溫搖床200轉/min振蕩20min后，將洗脫的土壤混懸液離心，棄上清液，所得沉淀即為根際土樣品。將1g煙草根際土壤放入無菌三角瓶中，加入9mL生理鹽水震蕩20min，靜置5min，待土壤均勻分散開，按10倍遞減稀釋法稀釋后于LA培養(yǎng)基上涂布。細菌分離純化后，挑取單菌株置于30%甘油中，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 產IAA菌株的篩選 定性初篩：向滅菌后的LB液體培養(yǎng)基加入100mg/L L-色氨酸，接入供試菌株180轉/min培養(yǎng)2d，4 000轉/min離心10min，吸取2mL上清液，加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30min，觀察其顏色變化，以50mg/L的標準IAA作對照，變粉紅色為具有產IAA能力的菌株。

定量復篩：將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)24h后，在600nm波長分光光度計下調節(jié)OD600值為0.8后備用。將菌株發(fā)酵液4 000轉/min離心10min，吸取3mL上清液，加入等體積Salkowski比色液，重復3次，靜置30min后測定530nm處的吸光值，以未接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對照，以IAA濃度為橫坐標、OD530為縱坐標制作IAA標準曲線，通過標準曲線計算IAA產量[13-14]。

1.2.3 產IAA菌株的鑒定 采用改進的SDS-CTAB方法提取細菌基因組DNA[15]，選用16S rRNA通用引物27f/1492r，以細菌DNA為模板，配制25 μ L PCR反應體系進行擴增[12]。PCR產物委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序，擴增產物測序結果在GenBank進行BLAST比對以獲取相似性最高的植株。

1.2.4 菌株間拮抗反應測定 將篩選出的產IAA能力最大的2株菌株m-53和m-60進行拮抗反應測試。菌株活化后兩兩相交接種于LB平板上，并在30℃下培養(yǎng)24～48h，觀察接觸部位細菌生長情況，若接觸部位細菌生長不良或不生長，則說明這2株菌株之間存在拮抗作用，不宜混合培養(yǎng)；反之，則說明2株菌株之間無抑制作用，可以混合培養(yǎng)。

1.2.5 產IAA菌株培養(yǎng)時間的確定 采用單因素法，于搖床分別振蕩培養(yǎng)12、24、36、48、60、72和84h，計算出相應的IAA產量，從而確定最佳培養(yǎng)時間。

1.2.6 煙草種子萌發(fā)試驗 根據最佳培養(yǎng)時間培養(yǎng)產IAA菌制備菌懸液，種子經1% CuSO4和0.5%ZnSO4溶液分別浸種30和15min，無菌水沖洗3～5次備用。將消毒后的煙草種子在菌懸液中浸泡30min，對照（CK）為未接菌處理，種子浸泡在無菌液體培養(yǎng)基中。將種子置于滅菌后的培養(yǎng)皿中，每皿100粒，重復3次，于26℃光照培養(yǎng)144h，每12h觀察種子萌發(fā)情況，于第7天測定苗長和根長。計算發(fā)芽指標：發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數（發(fā)芽指數=∑Gt/Dt，Gt為發(fā)芽試驗終期內每日發(fā)芽數，Dt為發(fā)芽日數）、活力指數（活力指數=GI×S，GI為發(fā)芽指數，S為規(guī)定日期內幼苗或幼根的長度或質量）。

1.2.7 煙草盆栽育苗試驗 將經表面消毒后的煙草種子與菌懸液拌種處理，均勻播撒在混有細砂的滅菌花盆中，以無菌液體培養(yǎng)基拌種作為對照，出苗后每隔1周灌根1次。出苗后第30天，取10株長勢均勻一致的煙苗測定其株高、莖圍、葉片數、根長、最大葉長、最大葉寬、地上部鮮重和地下部鮮重。

1.3 數據處理

利用Excel 2010繪制圖表，利用SPSS 17.0對數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 產IAA菌株的篩選與鑒定

經定性篩選得到產IAA菌株27株。通過定量測定（表1），發(fā)現菌株m-53與m-60產IAA量超過40.00mg/L，故挑選這2株菌株進行下一步研究，其形態(tài)示于圖1；經分子鑒定獲得m-53與m-60 16S rRNA的相似性比對結果（表2）。

表1 煙草根際細菌產IAA能力Table 1 The ability of IAA production of rhizosphere bacteria from tobacco mg/L

圖1 m-53和m-60菌株形態(tài)Fig.1 Morphology of m-53 and m-60 strains

表2 細菌16S rRNA序列與GenBank-BLAST比對結果Table 2 Comparison of 16S rRNA sequence and GenBank-BLAST of bacteria

2.2 菌株間的拮抗測定

菌株間拮抗測定結果（圖2）顯示，m-53與m-60菌株間不發(fā)生拮抗反應，即2種菌株可以混合培養(yǎng)。

2.3 培養(yǎng)時間對菌株生長及產IAA含量的影響

由圖3可知，菌株m-53生長迅速且于培養(yǎng)24h時OD600達到最大值；菌株m-60初始生長緩慢，但于培養(yǎng)48h時OD600達到最大值；2株混合培養(yǎng)OD600最大值高于單獨培養(yǎng)，且于培養(yǎng)60h時達到峰值，說明二者具有相互促進的作用。

圖2 m-53與m-60菌株間拮抗反應結果Fig.2 The results of antagonistic reaction between m-53 and m-60 strains

圖3 培養(yǎng)時間對菌株及其組合生長的影響Fig.3 The effects of culture time on the growth of strain and its combination

由圖4可以看出，在培養(yǎng)24h時，菌株m-53產IAA最多，且顯著高于其他培養(yǎng)時間；菌株m-60在培養(yǎng)48h時產IAA最多；2株混合培養(yǎng)在48h時IAA產量最高。

圖4 培養(yǎng)時間對菌株及組合產IAA能力的影響Fig.4 The effects of culture time on IAA production ability of strain and its combination

2.4 產IAA菌株對煙草種子萌發(fā)的影響

由表3可知，2種促生菌單獨施用和混合施用都可以增加吉煙9號煙草種子的發(fā)芽指標。對于發(fā)芽勢來說，混合施用顯著高于其他處理，與CK相比增加了30.61%；對于發(fā)芽率來說，施菌處理高于CK，但無顯著差異；對于發(fā)芽指數來說，混合施用效果最佳，且比CK增加19.64%；對于活力指數來說，施用m-53與混合施用均顯著高于CK，其中混合施用效果最佳，與CK相比增加25.39%。綜上，2種促生菌均能促進煙草種子萌發(fā)且混合施用比單獨施用效果更好。

表3 促生菌對煙草種子發(fā)芽指標的影響Table 3 The effects of bacteria on germination indexes of tobacco seeds

2.5 產IAA菌株對煙草幼苗農藝性狀的影響

由表4和圖5可知，m-53單獨施用和2種促生菌混合施用對煙草的株高、根長、最大葉長、最大葉寬、莖圍和葉片數均有促進作用，且混合施用的效果最佳，除根長外，m-60與CK無顯著差異。

表4 促生菌對煙苗農藝性狀的影響Table 4 The effects of bacteria on agronomic traits of tobacco seedlings

圖5 促生菌對煙苗生長的影響Fig.5 The effects of growth-promoting bacteria on the growth of tobacco seedlings

2.6 產IAA菌株對煙苗生物量的影響

由表5可知，m-53單獨施用和2種促生菌混合施用對煙苗生物量均有顯著影響，且混合施用的效果更佳。m-60與CK間根冠干重比差異顯著。與CK相比，混合施用對煙苗地上部干重和鮮重、地下部干重和鮮重，及干重和鮮重根冠比有顯著增加的作用，地上部鮮重為CK的2.3倍，地上部干重為CK的2.63倍，地下部鮮重為CK的4.31倍，地下部干重為CK的4.57倍。根冠比反映植物地下部與地上部的相關性，鮮重根冠比相較于CK增加了86.11%，干重根冠比相比于CK增加了68.81%。

表5 促生菌對煙苗生物量的影響Table 5 The effects of bacteria on biomass of tobacco seedlings

3 討論

IAA作為植物中最重要的生長素之一，其作用主要有促進植物生長和細胞分裂、增加并促進根的分化及其生物量的增大、維持頂端優(yōu)勢等。低濃度的IAA促進細胞的伸長；當濃度高到一定值時，會抑制其促進細胞伸長的作用。目前，國內外有關PGPR產IAA的研究多集中在芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、固氮菌屬（Azotobacter）等[16-17]，但不同菌株IAA分泌量差異較大。本試驗分離篩選產IAA菌株鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacteriumsp.）m-53與咸海鮮球菌屬（Jeotgalicoccussp.）m-60，其產IAA能力分別為43.06和41.37mg/L，略高于吳翔等[18]從煙草根際土壤中分離篩選的Bacillus flextts菌株（28.16mg/L）；與張英等[19]從西藏阿里地區(qū)采集披堿草根系及根際土壤中篩選出的菌株NXP17分泌IAA能力相差不大。

優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件可實現菌株生產最大化。本試驗通過單因素試驗確定m-53、m-60及二者混合的最佳培養(yǎng)時間分別為24、48和48h，其對應的IAA產量分別為98、41和141mg/L。研究表明，菌株的生產發(fā)酵效率與培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件有密切關系[20]。徐婧等[21]對產IAA菌株GMZB-12進行優(yōu)化后，IAA產量為36.88mg/L，比優(yōu)化前提高7.75mg/L。

生長素是促進不定根形成的主要因素，可以調控側根的形成，外源施加生長素可以激活中柱鞘形成側根原基[22]。研究表明，PGPR促生效果明顯，能有效提高農作物對土壤中養(yǎng)分的吸收和轉化且提高作物的生物量。王婧[23]用濃度為106cfu/mL的橘黃假單胞菌JD37菌液浸種和107cfu/mL的菌液處理幼苗，發(fā)現其對番茄種子及幼苗均具有一定的促生作用。Zemrany等[24]在試驗中通過增施促生菌肥提高玉米鮮重34%。王辰月等[25]研究中也發(fā)現產IAA細菌對種子萌發(fā)具有促進作用。本試驗通過研究產IAA促生菌單菌株和混合菌株對煙草種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的影響，結果表明單獨施用和混合施用菌株均能促進種子萌發(fā)，能有效提高煙苗各項農藝性狀及生物量，且混合施用菌株優(yōu)于單獨施用，這與劉青海[26]試驗結果一致。產IAA促生菌一般同時具有多種促生功能，但菌株m-53與m-60的促生作用機理尚有待于進一步研究。

4 結論

本試驗從延邊煙草根際土壤中篩選出的鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacteriumsp.）m-53與咸海鮮球菌屬（Jeotgalicoccussp.）m-60產IAA效果較好，優(yōu)化培養(yǎng)條件后發(fā)現m-53、m-60及二者混合的最佳培養(yǎng)時間分別為24、48和48h，其對應的IAA產量分別為98、41和141mg/L。與對照相比，在種子萌發(fā)及盆栽試驗中發(fā)現，單一菌和混合菌劑均能促進種子萌發(fā)及幼苗生長，尤以混合菌劑效果最佳。