吳俊林 郭傳濱 賈真 郝浩浩 許曉敬 楊立均 孫會(huì)忠

摘要?采用火焰分光光度法對(duì)從煙草根際土壤中分離到細(xì)菌ZMD02的解鉀活性進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，在28?℃、180?r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)7?d后，菌株ZMD02發(fā)酵液中水溶性速效鉀含量達(dá)1.5?μg/mL，故將ZMD02定性為硅酸鹽菌株。對(duì)ZMD02的生長特性研究表明，ZMD02對(duì)不同糖源的發(fā)酵產(chǎn)氣能力表現(xiàn)為葡萄糖>麥芽糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉;對(duì)碳同化能力表現(xiàn)為麥芽糖>葡萄糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉;ZMD02對(duì)不同氮源的同化能力表現(xiàn)為酵母膏>蛋白胨>硫酸銨>硝酸鉀>尿素;ZMD02的最適生長溫度為30?℃，最適pH為7。ZMD02菌株可作為煙草生物鉀肥開發(fā)的備用菌株。

關(guān)鍵詞?煙草;解鉀菌;生長特性

中圖分類號(hào)?S572文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）07-0170-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.048

Potassium?Dissolving?Activity?and?Growth?Characteristics?of?Silicate?Bacteria?ZMD02

WU?Junlin，GUO?Chuanbin，JIA?Zhen?et?al

（Zhumadian?Branch?of?Henan?Provincial?Tobacco?Company，Zhumadian，?Henan?463000）

Abstract?The?potassium?activity?of?bacteria?ZMD02?isolated?from?tobacco?rhizosphere?soil?was?determined?by?flame?spectrophotometry.?The?results?showed?that?after?7?days?of?fermentation?at?28?℃?and?180?r/min，?the?content?of?watersoluble?rapidly?available?potassium?in?ZMD02?fermentation?broth?reached?1.5?μg/mL.?Therefore，?ZMD02?was?characterized?as?silicate?strain.?The?growth?characteristics?of?ZMD02?showed?that?the?order?of?fermentation?capacity?of?ZMD02?to?different?sugar?sources?was?glucose?>?maltose?>?lactose?>?amylose?>?amylose.?The?order?of?carbon?assimilation?ability?was?maltose?>?glucose?>?lactose?>?amylose?>?amylose.?The?order?of?assimilation?ability?of?ZMD02?to?different?nitrogen?sources?was?yeast?extract?>?peptone?>?ammonium?sulfate?>?nitrate?>?urea.?The?optimum?growth?temperature?of?ZMD02?was?30?℃?and?the?optimum?pH?was?7.?ZMD02?strain?could?be?used?as?an?alternative?strain?for?the?development?of?biopotash?fertilizer?in?tobacco.

Key?words?Tobacco;Silicate?bacteria;Growth?characteristics

基金項(xiàng)目?河南省煙草公司駐馬店市公司項(xiàng)目“植煙土壤的微生物定向調(diào)控保育技術(shù)研究”;河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（16A180003）。

作者簡介?吳俊林（1986—），男，河南駐馬店人，助理農(nóng)藝師，從事煙葉生產(chǎn)與管理研究。

收稿日期?2019-10-02

鉀不是生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分，但鉀素具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、保持細(xì)胞的滲透壓、吸收養(yǎng)分和構(gòu)成酶的輔酶等生理功能，由于鉀易被植物秸稈、果實(shí)、籽粒等形式帶走，土壤作為一個(gè)天然鉀庫，90%～98%的鉀存在于硅酸鹽礦物質(zhì)中，植物并不能直接吸收利用[1-3]。因此，必須不斷補(bǔ)充鉀才能滿足植物生長發(fā)育的需要，尤其對(duì)于嗜鉀作物煙草而言，補(bǔ)充鉀素顯得尤為重要[4-6]。解鉀菌（silicate?bacterium）是一類可以分解硅酸鹽礦物的細(xì)菌，也稱為硅酸鹽細(xì)菌，它能夠使礦物中的鉀分解為植物科吸收利用的有效鉀[7-9]。隨著煙草有機(jī)（綠色）生產(chǎn)發(fā)展理念的提倡和推廣，生物鉀肥在煙草產(chǎn)量提高和品質(zhì)改善方面的作用越來越受到重視，在此大背景下，分離篩選野生解鉀菌菌種資源具有極強(qiáng)的理論價(jià)值和應(yīng)用潛力。筆者從煙草根際土壤分離到一株細(xì)菌，編號(hào)為ZMD02，對(duì)其解鉀活性及其生長特性進(jìn)行研究，以期為該菌株的誘變育種、生物鉀肥開發(fā)等下游研究奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

解鉀菌ZMD02：分離于煙草的根際土壤，保存于駐馬店市煙草公司生產(chǎn)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室。

解鉀菌發(fā)酵培養(yǎng)基：按100?g培養(yǎng)基計(jì)，分別含有鉀長石0.30?g（超純水水洗5次），磷酸氫二鈉0.20?g，碳酸鈣0.01?g，七水硫酸鎂0.5?mg，三氯化鐵0.5?mg，蔗糖0.50?g，海藻糖0.10?g，瓊脂粉1.80?g，pH控制在7.0～7.5。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖6.00?g，硫酸鎂0.30?g，硫酸銨0.20?g，氯化鈉5.00?g，瓊脂粉18.00?g，蒸餾水1?L，pH?7.0。

斜面培養(yǎng)基：采用LB培養(yǎng)基[10]。

1.2?方法

1.2.1?菌株產(chǎn)鉀能力測定。

目標(biāo)菌株在LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)后，取OD600=0.2的菌液按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置不接種的空白對(duì)照，在28?℃、160?r/min條件下培養(yǎng)7?d。每24?h取樣一次，于4?℃、1?000?r/min離心10?min，采用火焰分光光度計(jì)測定離心后上清液中水溶性速效鉀含量[2，11]。3次重復(fù)取平均值，下同。

1.2.2?菌株生長特性測定。

糖發(fā)酵能力：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別選取葡萄糖、支鏈淀粉、直鏈淀粉、麥芽糖和乳糖作為糖源配制培養(yǎng)基，按2%接種量（OD600?=?2，下同）接入待測菌株，在28?℃培養(yǎng)48?h，觀察杜氏管內(nèi)氣體高度。

碳同化能力：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別選取葡萄糖、支鏈淀粉、直鏈淀粉、麥芽糖和乳糖作為碳源配制培養(yǎng)基，按2%接種量接入待測菌株，培養(yǎng)28?℃培養(yǎng)72?h，用分光光度計(jì)測定菌體OD600。

氮同化能力：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別選取硫酸銨、硝酸鉀、尿素、酵母膏和蛋白胨作為氮源，按2%接種量接入目標(biāo)菌株，28?℃培養(yǎng)72?h，用分光光度計(jì)測定菌體OD600。

生長溫度：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別按2%接種量接入待測菌株，分別置于16、20、24、28、32、36、40?℃條件下培養(yǎng)72?h，用分光光度計(jì)測定菌體OD600。

生長pH：分別將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH調(diào)整為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按2%接種量接入待測菌株，28?℃培養(yǎng)72?h，用分光光度計(jì)測定菌體OD600。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株ZMD02的解鉀能力

經(jīng)過7?d連續(xù)發(fā)酵，菌株ZMD02發(fā)酵上清液中，速效鉀含量存在變化，發(fā)酵液中的速效鉀含量從第3天開始迅速增加，第6天達(dá)到最大值1.5?μg/mL，而對(duì)照的速效鉀含量未見增加，說明未接種ZMD02的對(duì)照中不存在從鉀長石中分解釋放出的游離態(tài)有效鉀（圖1）。故ZMD02具有解鉀活性，定性為解鉀菌。

2.2?菌株ZMD02的生長特性

由圖2可知，菌株ZMD02對(duì)5種糖源的發(fā)酵產(chǎn)氣能力存在明顯差異，由大到小依次為葡萄糖>麥芽糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉。考察ZMD02對(duì)碳同化的能力時(shí)，也顯示出不同，由大到小為麥芽糖>葡萄糖>乳糖>直鏈淀粉>支鏈淀粉，說明麥芽糖是菌株生長的最佳碳源（圖3）。ZMD02對(duì)5種氮源的同化能力表現(xiàn)為酵母膏>蛋白胨>硫酸銨>硝酸鉀>尿素（圖4）。ZMD02的最適生長溫度為28?℃，低于20?℃和高于36?℃時(shí)，菌株長勢明顯減弱（圖5）。中性酸堿度環(huán)境是ZMD02的最適生長pH（圖6）。

3?討論

該研究從煙草根際土壤中分離獲得菌株ZMD02，菌株經(jīng)7?d發(fā)酵后發(fā)酵上清液中速效鉀含量達(dá)1.5?μg/mL，解鉀活性較強(qiáng)，無論作為誘變育種的出發(fā)菌株或直接作為生物鉀肥原始菌株，均具有較高的研究價(jià)值和開發(fā)潛力。土壤是微生物的大本營，根際環(huán)境因?yàn)橹参锔祷顒?dòng)與微生物的代謝經(jīng)過長期的協(xié)同進(jìn)化，從根際環(huán)境分離出的土著菌株，在應(yīng)用開發(fā)上具有天然的生態(tài)適應(yīng)性優(yōu)勢[12-13]，因此，ZMD02對(duì)煙草生產(chǎn)具有重要意義。雖然土壤中微生物種類繁多，但不同生境的微生物多樣性特征存在差異，很多時(shí)候即使是同一種微生物，來源不同，微生物個(gè)體的生物學(xué)特征也表現(xiàn)出特定的差異[12，14]，因此大量分離功能菌株，仍是一項(xiàng)非常具有價(jià)值的基礎(chǔ)性工作。

土著菌株初始酶活性的高低常常不能作為判斷該菌株是否具有價(jià)值的唯一依據(jù)，且土著野生菌株直接應(yīng)用往往出現(xiàn)田間施用效果不穩(wěn)定的情況，故后期通過紫外線、化學(xué)誘變劑等提高土著出發(fā)菌株的功能效果，幾乎是菌株深度開發(fā)的必要環(huán)節(jié)[15-17]，因此，對(duì)ZMD02的后續(xù)工作將著重加強(qiáng)這方面的研究。該研究對(duì)ZMD02菌株生長特性的初步探索，明確了菌株不同碳源、氮源、生長溫度和酸堿度的響應(yīng)特征，也為后期的理論和應(yīng)用研究提供了有益參考。

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