楊一恭 孫新強 盛保偉 陳克杰 徐慧麗

摘 要：以達托霉素產(chǎn)生菌--玫瑰孢鏈霉菌DT-04-11為出發(fā)菌株，采用紫外線照射60s，DES誘變處理40min，并結合鏈霉素耐受性突變株的理性化篩選，選育得到較佳誘變株DT-04-11-19，A21978C效價達到了7073μg/mL，且傳代性能穩(wěn)定，以此突變株為出發(fā)菌株，采用50L小罐發(fā)酵培養(yǎng)實驗表明，28℃培養(yǎng)204h左右，達托霉素效價達2620μg/mL。

關鍵詞：達托霉素;菌種選育

達托霉素是一類新型的抗菌譜廣、給藥小、藥效快以及副作用小的脂肽類抗生素，主要用于治療革蘭氏陽性菌，目前其制劑已在臨床上廣泛使用，療效很好。國內(nèi)外如何提高其產(chǎn)量的研究一直在進行。

目前隨著抗生素的廣泛使用，病原菌對抗生素的耐藥性也越來越強。革蘭氏陽性菌感染的病例越來越多，作為治療嚴重革蘭氏陽性菌感染的萬古霉素，其臨床應用效果已經(jīng)下降。因此，開發(fā)新型的高效的抗生素意義重大，達托霉素由于有著獨特的化學結構和作用機制，并且在臨床上表現(xiàn)出抗菌譜廣、給藥小、藥效快以及副作用小[1，2]等諸多特點，備受人們的關注。因此提高達托霉素的生產(chǎn)性能，實現(xiàn)達托霉素產(chǎn)品的市場化，具有重要的科學意義和經(jīng)濟效益。本研究采用紫外線照射和DES誘變處理，并結合鏈霉素耐受性突變株的理性化篩選，進行達托霉素高產(chǎn)菌株的選育，并對該菌株的發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，以獲得達托霉素的優(yōu)良菌株和較理想的發(fā)酵工藝，進而為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）DT-04-11，系浙江醫(yī)藥股份有縣公司新昌制藥廠保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

斜面及平板培養(yǎng)：采用高氏一號培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)8～9天。

種子培養(yǎng)：750mL三角瓶裝75mL培養(yǎng)基，置旋轉式搖床28℃，250r/min振蕩培養(yǎng)24h。培養(yǎng)基組成為（g/L）：麥芽糊精2.0%，蛋白胨3.0%，葡萄糖2.0%，pH7.5。

搖瓶發(fā)酵：250mL三角瓶裝30mL培養(yǎng)基，接種量為5%，置旋轉式搖床28℃，250r/min振蕩培養(yǎng)204h。培養(yǎng)基組成為（g/L）：麥芽糊精15.0%、葡萄糖2.0%、酵母粉3.0%、六水合硫酸亞鐵銨0.1%、消泡劑0.02%，初始pH7.5。

1.3 誘變處理

紫外線照射：將單孢子懸液置紫外誘變箱（紫外燈功率30W，波長253.7nm，照射距離30cm）中誘變處理一定時間，避光放置過夜，取樣經(jīng)梯度稀釋后涂布平板，28℃，避光培養(yǎng)9天，挑取單菌落轉接斜面。

DES誘變：分別取0.1mol/LpH7.2的磷酸緩沖液制備單孢子懸浮液，與DES（用乙醇溶解）混合成一定濃度，置搖床恒溫處理40min，經(jīng)梯度稀釋后涂平板，以未經(jīng)誘變的單孢子懸液做對照，28℃培養(yǎng)9天，挑取單菌落傳斜面。

1.4 鏈霉素耐受性突變株篩選

將經(jīng)紫外線照射，DES處理或者二者聯(lián)合處理后得到的孢子懸浮液稀釋后，分別涂布于含有一定鏈霉素濃度的分離平板上，28℃培養(yǎng)9天。

1.5 分析方法

①pH測定：pH電極測定;

②總糖及還原糖含量測定：裴林法;

③氨基氮測定：甲醛法;

④菌絲濃度測定：取10mL待測培養(yǎng)液，放在離心管中，5000rpm，測得沉淀物在發(fā)酵液中所占的比例即為菌絲濃度;

⑤達托霉素含量測定：采用高效液相法。固定相：Kromasil C18色譜柱;流動相：55：45（體積比）的含有0.1%三氟乙酸的水：含有0.1%三氟乙酸的乙腈，柱溫為30℃，流速1.5mL/min，檢測器波長214nm紫外光。

2 結果與討論

菌種選育：

2.1 UV紫外誘變結果

試驗中對出發(fā)菌株進行了不同時間的UV誘變處理，待菌落生長成熟后，從每個處理劑量平板中挑取單菌落，各轉接斜面，逐一接種發(fā)酵瓶，考察誘變劑的發(fā)酵水平，并統(tǒng)計其致死率和正突變率。所得結果如表1所示。

由表1可知，當UV照射50S時所得正變率最高，故后續(xù)實驗中均采用UV照射50S的誘變劑量。

2.2 DES誘變處理結果

硫酸二乙酯（DES）是一種常用的化學誘變劑，其誘變效應受酸堿條件影響。實驗中在不同pH條件下以不同劑量DES處理單孢子懸液，處理時間均為40min。當處理時間為40min時，在pH5.5，DES濃度4.0mg/mL和pH8.5，DES濃度3.0mg/mL時所得正變率最高。當pH5.5、DES處理劑量為3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL時，致死率分別為63.1%、82.6%、98.1%，正變率分別為22.3%、46.5%、19.8%;當pH8.5、DES處理劑量為2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL時，致死率分別為56.0%、86.2%、97.6%，正變率分別為20.1%、43.5%、27.9%。

2.3 鏈霉素耐受篩選

將經(jīng)過紫外線處理后的原始菌株和未經(jīng)處理的原始菌株的單孢子懸浮液，按照梯度稀釋后均勻涂布于鏈霉素濃度分別為1.0μg/mL、1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL、2.0μg/mL、2.2μg/mL的平板上，發(fā)現(xiàn)隨著鏈霉素濃度增加，平板上的菌落數(shù)減少，原始菌株對鏈霉素的耐受濃度最小為1.8μg/mL。結果如表2。

誘變株經(jīng)連續(xù)5次的傳代試驗，發(fā)酵效價穩(wěn)定在2000μg/mL以上，說明有比較穩(wěn)定的性能。

3 討論

文獻報道通過低能離子注入玫瑰孢鏈霉菌選育高產(chǎn)菌的探究使達托霉素發(fā)酵產(chǎn)量達到了1.72 g/L [3，4]本研究以玫瑰孢鏈霉菌DT-04-11為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線照射和DES誘變處理，并篩選鏈霉菌耐受菌株，選育得到了高產(chǎn)菌株DT-04-11-19，其效價較出發(fā)菌株提高了40%，以高產(chǎn)菌株為實驗菌株，進行傳代穩(wěn)定性實驗，實驗表明傳代穩(wěn)定，表明該菌株是具有良好開發(fā)前景的優(yōu)良菌株。在10L小試罐上實驗，發(fā)酵產(chǎn)量達到2.6g/L，對達托霉素工業(yè)化生產(chǎn)具有很好的借鑒和參考價值。

參考文獻：

[1]Debono M， Bernard J， Enzymatic and chemical modifications of lipopeptide antibiotic A21978C： the synthesis and evaluation of daptomycin （LY146032）[J].The journal of antibiotic， 1988（8）：1093-1105.

[2]Quinlan A V， Kinetics of secondary metabolite synthesis in batch culture when two different substrates limit cell growth and metabolite production： xanthan synthesis by Xanthomonas campestris， Annals of the New York Academy of Sciences[J].198，469：259-269.

[3]周劍，劉穎，方東升，等.氮離子注入玫瑰孢鏈霉菌選育達托霉素高產(chǎn)菌株的研究[J].輻射研究與輻射工藝學報， 2008，26（5）：317-320.

[4]周劍，黃建峰，張引，等.低能離子注入誘變達托霉素高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵的研究[J].中國抗生素雜志，2012，37（8）： 587-592.