文嗣鑫 王莉 鄧金蘭 紀(jì)冬穎 王兵 徐世琦

摘 ? ?要：為探明文冠果MAPK16基因的生物學(xué)特征及功能，根據(jù)文冠果de novo轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)搜索MAPK16基因的cDNA序列（XsMAPK16），并對(duì)XsMAPK16基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，XsMAPK16基因cDNA序列包含1個(gè)長(zhǎng)度為1 677bp的完整ORF，可編碼558個(gè)氨基酸。XsMAPK16蛋白大部分區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)，由235個(gè)ɑ螺旋、232個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，59個(gè)延伸鏈、32個(gè)β轉(zhuǎn)角構(gòu)成。依據(jù)2gcc.1.A同源建模法，獲得1個(gè)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，該模型從第12個(gè)氨基酸開(kāi)始到第362個(gè)氨基酸結(jié)束。XsMAPK16蛋白與12種其他植物MAPK蛋白的同源性分析顯示，文冠果MAPK16與甜橙MAPK的同源性最高（94.93%）。該結(jié)果將為解析文冠果抗旱的調(diào)控機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)，并為文冠果的抗旱育種提供新思路。?

關(guān)鍵詞：文冠果;MAPK16蛋白;親水性;ɑ螺旋;同源性

中圖分類號(hào)：F307.11; S341.1 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.02.004

Full-length cDNA Sequence and Bioinformatic Analysis of MAPK16 Gene from Yellow Horn

WEN Sixin， WANG Li， DENG Jinlan， JI Dongying， WANG Bing， XU Shiqi

（College of Environment and Resources， Dalian Minzu University， Dalian， Liaoning 116600， China）

Abstract： In order to explore the biological characteristic and function of MAPK16 gene from Xanthoceras sorbifolia （yellow horn）， the cDNA sequence of MAPK16 gene（XsMAPK16） was searched based on the de novo transcriptome data of yellow horn， and then the full-length cDNA sequence of XsMAPK16 gene was analyzed by bioinformatics. The results showed that the cDNA sequence of XsMAPK16 gene contained a complete ORF of 1677 bp， which encoded 558 amino acids. The majority of XsMAPK16 protein is hydrophilic， consisting of 235 helium spirals， 232 random coils， 59 extended strands， and 32 beta turns. According to the 2gcc.1.A homology modeling method， a tertiary structure model was obtained， ranging from the 12th amino acid to the 362th amino acid. The homology analysis of XsMAPK16 protein and MAPK proteins from 12 higher plants showed that MAPK16 had the highest homology with sweet orange MAPK （94.93%）. These results will provide a new theoretical basis for the analysis of the regulation mechanism of drought resistance of yellow horn， and provide new ideas for drought-resistant breeding of yellow horn.

Key words： Xanthoceras sorbifolia; MAPK16 protein; hydrophilic; ɑ helix; homology

植物為應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化會(huì)作出適應(yīng)性反應(yīng)從而進(jìn)化出了一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，外界刺激被傳遞到細(xì)胞內(nèi)部并轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的胞內(nèi)信號(hào)以調(diào)控下游反應(yīng)[1]。蛋白激酶特定位點(diǎn)上氨基酸殘基的磷酸化以及去磷酸化是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的主要途徑之一[2]。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是植物體內(nèi)MAPK信號(hào)通路的重要成員之一，與植物體的生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等密切相關(guān)[3]。MAPK與促分裂原激活蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK）以及促分裂原激活蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）通過(guò)逐級(jí)磷酸化構(gòu)成了MAPKKK→MAPKK→MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑[4]。保守的蛋白激酶MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)是真核生物應(yīng)答和傳導(dǎo)外界信號(hào)的關(guān)鍵通路[5-10]。植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑可以響應(yīng)多種生物脅迫（真菌、細(xì)菌侵染）和非生物脅迫（高鹽、低溫、干旱、活性氧爆發(fā)、激素誘導(dǎo)、組織機(jī)械損傷）。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)MAPK參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆過(guò)程的研究主要集中在擬南芥[11]、煙草[12]等植物中，已發(fā)現(xiàn)了大量MAPK家族成員。

文冠果（Xanthoceras sorbifolia）是我國(guó)北方特有的木本食用油料樹(shù)種[13]，易繁殖，具有耐旱[14]、耐寒[12]、耐瘠薄和鹽堿[15]等抗逆特征。然而木本油料文冠果中MAPK研究仍為空白。本研究擬在文冠果轉(zhuǎn)錄組的基因注釋結(jié)果搜索得到MAPK16基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并采用生物信息學(xué)相關(guān)方法來(lái)分析MAPK16蛋白的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)，為解析文冠果干旱脅迫抗性的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，對(duì)文冠果抗旱種質(zhì)的篩選和育種具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 搜索文冠果轉(zhuǎn)錄組獲得XsMAPK16基因的cDNA序列

根據(jù)大連民族大學(xué)資源植物研究所高通量測(cè)序獲得的文冠果根、莖、葉的de novo轉(zhuǎn)錄組的基因注釋結(jié)果搜索獲得XsMAPK16基因的cDNA序列，用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.2 文冠果XsMAPK16基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析

XsMAPK16基因cDNA序列的ORF區(qū)：利用NCBI 網(wǎng)站的ORF Finder在線軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)遺傳代碼進(jìn)行預(yù)測(cè);XsMAPK16蛋白序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)：使用ProtParam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行預(yù)測(cè);XsMAPK16蛋白的疏水性/親水性：通過(guò)ProtScale在線軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行分析;XsMAPK16蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)：利用SOPMA在線軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/securedsopma.pl）進(jìn)行預(yù)測(cè);XsMAPK16蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)：采用SWISS-MODEL軟件（http：// www.swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 文冠果MAPK16與其他植物MAPK氨基酸序列的同源性比較

利用DNAman軟件對(duì)文冠果MAPK16氨基酸序列和克萊門(mén)柚（Citrus clementia）、甜橙（Citrus sinensis）、可可（Theobroma cacao）、胡楊（Populus euphratica）、木薯（Manihot esculenta）、榴蓮（Durio zibethinus）、麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas）、棗（Ziziphus jujuba）、白樺（Betula platyphylla）、歐洲甜櫻桃（Prunus avium）等10種其他植物的MAPK氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，上述10種植物的MAPK氨基酸序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果XsMAPK16基因cDNA序列的ORF

文冠果XsMAPK16基因cDNA序列的ORF分析結(jié)果顯示，XsMAPK16基因包含1個(gè)長(zhǎng)度為1 677 bp的ORF，可編碼氨基酸個(gè)數(shù)為558個(gè)（圖1）。

2.2 XsMAPK16蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)

利用ProtParam在線軟件對(duì)XsMAPK16基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，XsMAPK16蛋白分子式為C2836H4455N789O819S22，相對(duì)分子質(zhì)量為63 413.69，等電點(diǎn)為8.86，脂肪系數(shù)為78.69，不穩(wěn)定系數(shù)為35.67，正電荷（精氨酸+賴氨酸）殘基80個(gè)，負(fù)電荷（天冬氨酸+谷氨酸）殘基71個(gè)，平均疏水性為

-0.475，其中正值表示疏水性，負(fù)值表示親水性，且該值越高則表示該性質(zhì)越強(qiáng)。說(shuō)明XsMAPK16為穩(wěn)定的親水性蛋白，這與其疏水性/親水性分析結(jié)果基本一致。

2.3 XsMAPK16蛋白疏水性/親水性分析

由圖2可見(jiàn)XsMAPK16蛋白的疏水性最大值為2.298，最小值為-2.898，說(shuō)明XsMAPK16蛋白中大部分氨基酸為親水性氨基酸，與其理化性質(zhì)分析結(jié)果相一致。

2.4 XsMAPK16蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)

基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用SOPMA軟件對(duì)XsMAPK16蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖 3）顯示，XsMAPK16蛋白由235個(gè)ɑ螺旋、232個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲、59個(gè)延伸鏈、32個(gè)β轉(zhuǎn)角構(gòu)成，分別占42.11%、41.58%、10.57%、5.73%，其中ɑ螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例分別位列第1、2位，可以推測(cè)文冠果XsMAPK16蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)元件是以ɑ級(jí)螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲的形式存在，而β旋轉(zhuǎn)角和延伸鏈散布在整個(gè)蛋白質(zhì)中。

2.5 XsMAPK16蛋白序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)

利用同源建模法，將XsMAPK16蛋白質(zhì)序列提交至SWISS-MODEL，根據(jù) 2gcc.1.A同源建模法，得到1個(gè)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖4），該模型從第12個(gè)氨基酸開(kāi)始到第362個(gè)氨基酸結(jié)束，主要由ɑ氨螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β旋轉(zhuǎn)角組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.6 XsMAPK16蛋白序列與其他植物MAPK蛋白序列的同源性比較

將XsMAPK16氨基酸序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線比對(duì)，選擇與其同源性較高的10種植物的MAPK氨基酸序列：克萊門(mén)柚MAPK15（Citrus clementia，XP_006419783.1）、甜橙MAPK15（Citrus sinensis，XP_006489245.1）、可可MAPK15（Theobroma cacao，XP_007034572.1）、胡楊MAPK15（Populus euphratica，XP_011009014.1）、木薯MAPK15（Manihot

esculenta，XP_021594735.1）、榴蓮MAPK16（Durio zibethinus，XP_022761951.1）、麻風(fēng)樹(shù)MAPK15（Jatropha curcas，XP_012069504.1）、棗MAPK15（Ziziphus jujuba，XP_015888257.1）、白樺MAPK16（Betula platyphylla，AHX99574.1）、歐洲甜櫻桃MAPK16（Prunus avium，XP_021806466.1）。利用DNAman軟件將這些序列進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同植物的MAPK氨基酸序列同源性較高，其中文冠果XsMAPK16氨基酸序列與甜橙MAPK15氨基酸序列的同源性最高，達(dá)到94.93 %。多重序列比對(duì)結(jié)果如圖5所示，深色部分表示高度的保守氨基酸序列，第41個(gè)至第450個(gè)氨基酸序列存在較長(zhǎng)的相對(duì)保守重疊區(qū)。

3 結(jié)論與討論

MAPK蛋白是植物體內(nèi)MAPK信號(hào)通路的重要成員，與植物體的生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。本研究通過(guò)將文冠果MAPK16氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中10種其他植物的MAPK氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)文冠果MAPK16與克萊門(mén)柚、甜橙、可可、胡楊、木薯、榴蓮、麻風(fēng)樹(shù)、棗、白樺、歐洲甜櫻桃等10種植物均有較高的同源性，其中與甜橙同源性最高（94.93%）。這說(shuō)明文冠果與其他高等植物在MAPK氨基酸序列上第41個(gè)氨基酸至第450個(gè)氨基酸存在較長(zhǎng)的保守區(qū)域，從而在進(jìn)化上相對(duì)較為保守。本研究獲得文冠果MAPK家族成員——MAPK16全長(zhǎng)cDNA序列以及功能預(yù)測(cè)結(jié)果，將為文冠果抗旱種質(zhì)的分子育種提供重要參考，也為下一步將該基因的完整ORF區(qū)連接入表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到模式植物擬南芥中，進(jìn)行功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

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