金釵石斛居群內(nèi)石斛堿的含量差異比較

陸安靜，余丹丹，何慧雨，杜藝玫，張倩茹，白朝鈞,楊 洲，楊繼勇，

譚道鵬1，何芋岐1

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.貴州納蒂爾生物科技有限公司，貴州 貴陽 550009；3.廣州市凌瀚醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510080；4.上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司,上海 201203；5.赤水市信天中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，貴州 赤水 564700)

石斛(Dendrobium)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw.)多年附生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，稱其有“強陰益精、厚腸胃、補內(nèi)孢不足、輕身延年”之功效。金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)，又名扁金釵、扁黃草、扁草等，是現(xiàn)行版《中國藥典》石斛藥材的首要來源[1]。研究表明，金釵石斛中含有生物堿、聯(lián)芐、多糖、芴酮、酚類、倍半萜等多種有機小分子化合物[2-7]，其中生物堿(DendrobiumnobileLindl.alkaloids，DNLA)是《中國藥典》中金釵石斛的質(zhì)量控制成分。藥理學(xué)研究表明，金釵石斛中生物堿具有保護神經(jīng)、抗白內(nèi)障、抗腫瘤、降血糖和血脂等藥理作用[8-11]。石斛堿是石斛生物堿的特征化學(xué)成分[12]，現(xiàn)行《中國藥典》以石斛堿含量作為評判金釵石斛質(zhì)量的指標，規(guī)定石斛堿含量不得低于0.4%。

金釵石斛的人工栽培始見于明代，《本草綱目》記載“其莖狀如金釵之股，故古有金釵石斛之稱。今蜀人栽之，呼為金釵花?！_紅花”，貴州省赤水市在明代隸屬于四川行省之遵義軍民府，屬于《本草綱目》中所稱蜀中地區(qū)。1978年王用平介紹的貴州赤水縣金釵石斛的栽培方法[13]是石斛藥材現(xiàn)代人工栽培最早報道之一。因此，貴州赤水的金釵石斛人工栽培具有非常悠久的歷史傳承。迄今，赤水已建成國內(nèi)最大的金釵石斛附石仿野生栽培基地，并且取得了國家地理標志產(chǎn)品保護。目前，赤水當(dāng)?shù)亟疴O石斛采收習(xí)慣是剪取2～3年生枝條，而非整體采收。但對于居群內(nèi)不同枝條之間石斛堿含量的對比分析卻少見報道。不清楚居群內(nèi)不同枝條石斛堿含量，勢必對金釵石斛藥材、下游飲片及深加工產(chǎn)品的品質(zhì)造成影響。為深入研究金釵石斛的品質(zhì)影響因素，本文根據(jù)2015版《中國藥典》中石斛堿含量測定方法對貴州赤水市復(fù)興鎮(zhèn)凱旋村金釵石斛居群內(nèi)，不同叢、不同枝條的仿野生金釵石斛中石斛堿含量進行比較分析，發(fā)現(xiàn)金釵石斛居群內(nèi)石斛堿含量存在顯著差異，可以為金釵石斛的種植采收工藝的標準化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 氣相色譜儀(安捷倫7820型氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器)，電子分析天平(萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，石斛堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111876201704)，萘(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號：BCBZ3690)，高純氮(99.99%)，甲酸(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)，甲醇(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)，金釵石斛(54個仿野生金釵石斛樣本采自貴州赤水市凱旋村，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房楊建文主任藥師鑒定為蘭科植物金釵石斛(DendrobiumnobileLindl，樣本具體信息見表1)。

表1 金釵石斛樣本信息

叢數(shù)樣本編號生長年限海拔(米)第1叢CS201910101-1～ 31年生589.4CS201910101-4～ 62年生CS201910101-7～ 93年生第2叢CS201910102-1～ 31年生584.8CS201910102-4～ 62年生CS201910102-7～ 93年生第3叢CS201910103-1～ 31年生560.7CS201910103-4～ 62年生CS201910103-7～ 93年生第4叢CS201910104-1～ 31年生551.0CS201910104-4～ 62年生CS201910104-7～ 93年生第5叢CS201910105-1～ 31年生538.0CS201910105-4～ 62年生CS201910105-7～ 93年生第6叢CS201910106-1～ 31年生545.3CS201910106-4～ 62年生CS201910106-7～ 93年生

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 DB-1毛細管柱(柱長為30 m，內(nèi)徑為0.25 mm，膜厚度為0.25 μm)，程序升溫的初始溫度為80℃，以每分鐘10℃的速率升溫至250℃，保持5 min；進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為250℃，載氣流速1 mL/min，進樣量為1 μL，空氣流量300 mL/min，氫氣流量30 mL/min，尾吹氣25 mL/min，分流比為1∶1。按上述色譜條件進行分析得其色譜圖，見圖1。

1.2.2 溶液的制備 ①內(nèi)標及對照品溶液的制備：取萘標準品約12.5 mg，精密稱定，甲醇定容至10 mL，搖勻，制成每1 mL含1.25 mg萘的儲備液，4℃保存；精密量取1 mL，甲醇定容至50 mL，制成25 μg/mL的內(nèi)標溶液。取石斛堿對照品約5.0 mg，精密稱定，甲醇定容至5 mL，制成每1 mL含1 mg石斛堿的儲備液，搖勻，4℃保存；精密量取儲備溶液0.25 mL，加甲醇定容至5 mL，制成濃度為50 μg/mL的石斛堿溶液。取50.0 μg/mL的石斛堿溶液2 mL，25.0 μg/mL的內(nèi)標溶液1 mL，加甲醇定容至5 mL，即得對照品溶液。②供試品溶液的制備：取供試品(金釵石斛鮮品干燥后，粉碎，過3號篩)約0.25g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，用移液管精密加入0.05%甲酸-甲醇溶液25.0 mL，稱定重量；水浴提取3 h(80℃)，放冷，用0.05%甲酸-甲醇溶液補足失重。提取液濾過，精密量取續(xù)濾液2.0 mL，加內(nèi)標溶液1 mL，用0.05%甲酸-甲醇溶液定容至5 mL，搖勻，即得供試品溶液。

A：對照品；B： 供試品; 1:萘；2:石斛堿 圖1 石斛堿對照品及金釵石斛供試品的氣相色譜圖

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 標準曲線 精密量取100 μg/mL對照品溶液，制成含石斛堿濃度分別為0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4、50 μg/mL 的對照品溶液，記錄峰面積。以濃度(X)為橫坐標，峰面積比值(對照品峰面積/內(nèi)標物峰面積)(y)為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。標準曲線方程為y=0.1503x- 0.0293(R2=0.9999)，線性關(guān)系良好，說明石斛堿在0.3～50 μg/mL具有良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2 精密度試驗 取同一份對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積比值(對照品峰面積/內(nèi)標物峰面積)，RSD為0.5%，表明精密度良好。

1.2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，按1.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，記錄色譜峰面積比值(對照品峰面積/內(nèi)標物峰面積)，計算石斛堿含量，RSD為1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液分別在0、2、4、8、12、24、48 h進樣，記錄色譜峰面積比值(對照品峰面積/內(nèi)標物峰面積)，RSD為0.4%，表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.3.5 回收率試驗 稱量同一批已知含量(0.36%)供試品約0.125 g，共6份。按1∶1比例準確加入石斛堿對照品溶液(0.45 mg/mL)，按照1.2.2項下方法制備供試品溶液，記錄色譜峰面積比值(對照品峰面積/內(nèi)標物峰面積)，計算其平均回收率為90.3%，RSD%為2.4%，結(jié)果(見表2)。

表2 回收率試驗結(jié)果

稱樣量(g)樣品中量(mg)加入量(mL)測得量(mg)回收率(%)平均值(%)RSD(%)0.12520.45071.00000.863791.890.32.40.12530.45111.00000.865292.00.12530.45111.00000.845587.70.12540.45141.00000.866092.10.12540.45141.00000.860791.00.12540.45141.00000.845187.5

1.2.4 含量測定 吸取按1.2.2項下制備的供試品溶液1μL，注入氣相色譜儀，按1.2.1項下色譜條件測定。

2 結(jié)果

2.1 金釵石斛居群內(nèi)不同叢、不同年生枝條中石斛堿含量整體情況可視化分析 以生長年限為橫坐標，石斛堿百分含量為縱坐標對54個樣本進行分析，觀察不同叢、不同年生枝條金釵石斛中石斛堿含量差異及合格情況。結(jié)果如圖2所示，圖中每個點代表每一個樣本，不同顏色代表不同生長年限，不同形狀代表不同海拔，水平黑線為中國藥典規(guī)定的金釵石斛中石斛堿含量的標準限0.4%，低于此線代表不合格。由圖2可得，不同叢、不同枝條中石斛堿含量均有差異，第3叢年生3-3號樣本的石斛堿含量為最高，含量為0.94%，第6叢年生6-9號樣本石斛堿含量最低，含量為0.13%。同一叢樣本、不同枝條中石斛堿含量差異主要受生長年限影響。不同叢樣本間石斛堿含量差異主要受地勢因素影響。54個樣本中，石斛堿含量符合藥典標準樣本的有20個。不同生長年限、不同地勢因素下合格樣本分布情況不一樣。其中，1年生、2年生、3年生石斛堿含量合格樣本比例分別為78%、28%、6%；高地勢、低地勢石斛堿含量合格樣本比例分別為56%、19%(見圖3)。

圖2 金釵石斛中石斛堿含量整體情況散點分析圖

A：1年生；B：2年生；C：3年生；D：高地勢；E： 低地勢。圖3 不同生長年限、不同地勢石斛堿含量合格率

2.2 同一叢中不同年生枝條石斛堿含量差異分析 根據(jù)整體可視化分析結(jié)果可知，生長年限是同一叢中不同莖條石斛堿含量差異的主要因素，進一步進行統(tǒng)計分析。由圖4可得，不同生長年限下生長的金釵石斛中石斛堿含量具有差異且有規(guī)律性，隨著時間的推移，石斛堿含量逐漸下降，1年生>2年生>3年生。第1叢樣本中，3年生枝條石斛堿含量較兩年生枝條顯著降低(P<0.05)；第2叢樣本中，2、3年生枝條石斛堿含量分別較1年生枝條顯著降低(P<0.05)；第3叢、第6叢樣本中，與1年生枝條相比，2、3年生枝條石斛堿含量顯著降低，且3年生較2年生顯著降低(P<0.05)；第4叢與第5叢樣本中，隨著生長年限的延長，石斛堿含量逐漸降低，無顯著性差異。

a：2年生與1年生相比，P<0.05；b：3年生與1年生相比，P<0.05；c：3年生與2年生相比，P<0.05；n=3。圖4 不同生長年限下金釵石斛中石斛堿含量的變化

2.3 不同叢金釵石斛中石斛堿含量差異分析 根據(jù)整體可視化分析，進一步對不同叢金釵石斛中石斛堿含量進行分析。圖5，第1～3叢金釵石斛藥材采自高地勢，第4～6叢金釵石斛藥材采自低地勢，不同叢石斛堿含量均有差異，與第1、3叢相比時，第4、5、6叢中石斛堿含量分別顯著降低(見圖5，P<0.05)。進一步分析不同地勢對石斛堿含量的影響，對同1生長年限下不同地勢的石斛堿含量進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，1、2、3年生金釵石斛中，高地勢石斛堿含量高，與低地勢相比，均有顯著性差異(見圖6，P<0.05)。

a：與第一叢相比，P<0.05 ；b：與第3叢相比，P<0.05；n=9 。圖5 不同叢金釵石斛中石斛堿含量的變化

a：與低地勢相比，P<0.05；n=9。圖6 不同地勢金釵石斛中石斛堿含量差異比較

3 討論

石斛堿是金釵石斛中的主要有效成分，其含量是評估金釵石斛藥材內(nèi)在品質(zhì)的主要標準。中國藥典規(guī)定，按干燥品計算，石斛堿含量不得少于0.4%。已有文獻報道，不同生長地、采收月份、生長年限、生長部位等因素與石斛堿含量的關(guān)系[14-15]。但未見有金釵石斛居群內(nèi)叢與叢之間、同叢內(nèi)不同年生枝條石斛堿含量差異的相關(guān)報道。本實驗結(jié)果表明，金釵石斛居群內(nèi)同一叢中不同條金釵石斛中石斛堿均有明顯差異，并且有較多樣本中石斛堿含量未能達到中國藥典規(guī)定要求。不同樣本中石斛堿的含量與生長年限高度相關(guān)，不同年生枝條的石斛堿含量具有一定的規(guī)律性：1年生>2年生>3年生，這與顏壽等[16]的研究結(jié)果基本一致。金釵石斛藥材一般2～3年采收，但據(jù)不同生長年份的金釵石斛中石斛堿含量對比研究結(jié)果，1年生金釵石斛符合藥典標準的比例為78%，兩年生樣本次之，28%符合藥典標準，3年生樣本僅有6%符合藥典標準，因此金釵石斛藥材的采收有必要合理安排采收時間。

在生長年限相同的條件下，不同叢金釵石斛中石斛堿含量也均有所不同(見圖2)，結(jié)合地勢因素，高地勢金釵石斛中石斛堿含量明顯高于低地勢金釵石斛的石斛堿含量。因此，今后金釵石斛的栽培需要對地勢進行選擇。

本研究通過對金釵石斛居群內(nèi)不同叢、不同年生金釵石斛枝條中石斛堿含量對比研究發(fā)現(xiàn)，居群內(nèi)金釵石斛藥材中石斛堿含量存在明顯差異，并且直接關(guān)系到藥材質(zhì)量的合格與否，這對于金釵石斛批次內(nèi)藥材的質(zhì)量控制帶來較大挑戰(zhàn)，為保障金釵石斛藥材的品質(zhì)穩(wěn)定性，有必要對金釵石斛批次內(nèi)藥材增加抽檢樣品范圍，同時在種植源頭的地域、地勢等栽培條件及生長年限等采收條件進一步細化規(guī)范。