生長(zhǎng)環(huán)境及收獲期對(duì)野鴉椿屬植物三萜類化合物含量的影響

鄒小興，倪 林，黃 維，鄒雙全

（福建農(nóng)林大學(xué) a.林學(xué)院；b.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心；c.植物保護(hù)學(xué)院；d.生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

圓齒野鴉椿Euscaphis konishiiHayat為省沽油科Staphyleaceae野鴉椿屬Euscaphis常綠灌木或小喬木[1]，是具有重要價(jià)值的觀賞藥用植物，在抗炎、抗癌、保肝等方面作用顯著[2-6]，也是畬藥“雞眼睛”[7]和苗藥“血脈通膠囊”[8]的重要原料。近年來(lái)，多種具有顯著藥理活性的三萜類化合物已經(jīng)從同屬野鴉椿E.japonica植物體中分離得到[9-11]。但是，關(guān)于圓齒野鴉椿體內(nèi)三萜類化合物含量及其與野鴉椿三萜類化合物含量的差異、三萜類物質(zhì)在圓齒野鴉椿不同部位的分布情況、不同生長(zhǎng)區(qū)域和采收月份對(duì)圓齒野鴉椿體內(nèi)總?cè)祁惢衔锓e累的影響等方面的研究仍未見報(bào)道。為此，筆者針對(duì)以上問(wèn)題展開研究，以探尋三萜類化合物在野鴉椿和圓齒野鴉椿植物體內(nèi)積累的規(guī)律，為進(jìn)一步研究其藥用價(jià)值和科學(xué)栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地分別位于福建省邵武市將石自然保護(hù)區(qū)（以下簡(jiǎn)稱為“邵武”，SW）、清流縣益晟園林苗木基地（以下簡(jiǎn)稱為“清流”，QL）、福建農(nóng)林大學(xué)科技園（以下簡(jiǎn)稱為“農(nóng)大”，ND）和福州市閩清縣下祝鄉(xiāng)翁山頭（以下簡(jiǎn)稱為“閩清”，MQ）。圓齒野鴉椿種植密度為2 m×2 m。以GPS測(cè)定各試驗(yàn)地的經(jīng)緯度、海拔，從當(dāng)?shù)貧庀蟛块T采集各試驗(yàn)地的氣候因子數(shù)據(jù)。采集各試驗(yàn)地的土壤樣品，測(cè)定其堿解氮、速效磷和速效鉀含量。各試驗(yàn)地概況見表1。

表1 各試驗(yàn)地概況Tabble 1 Each test plot status

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)植株的選擇

2014年6月，分別在邵武、清流、農(nóng)大3個(gè)試驗(yàn)地選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的8年生圓齒野鴉椿各10株，在閩清試驗(yàn)地選擇6年生野鴉椿和圓齒野鴉椿各10株，掛牌標(biāo)記，進(jìn)行常規(guī)水肥管理。

1.2.2 樣品采集

閩清試驗(yàn)地野鴉椿和圓齒野鴉椿葉片和枝條的采樣時(shí)間為2014年8月；清流、邵武、農(nóng)大3個(gè) 試驗(yàn)地的采樣時(shí)間均分別為2014年11月（圓齒野鴉椿果實(shí)成熟即其旺盛生長(zhǎng)基本結(jié)束時(shí)期）和2015年3月（春季植株開始抽芽前時(shí)期），2014年 11月采集葉片、枝條、果實(shí)和種子，2015年3月只采集葉片和枝條。采集時(shí)，從掛牌標(biāo)記植株的不同方位采集葉片（2014年春季萌發(fā)的葉片）、枝條（頂芽往下約35 cm處）和果實(shí)。各樣品采集量均為500 g，分別放入信封中，帶回實(shí)驗(yàn)室以備用。

1.3 總?cè)坪康臏y(cè)定

將果皮和種子分離，然后將所有樣品經(jīng)40 ℃烘干，粉碎，過(guò)40目篩，低溫密封保存。利用高氯酸和5%的香草醛-冰醋酸溶液與三萜類化合物的顯色反應(yīng)，采用比色法[12]測(cè)定三萜類化合物的含量。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確吸取以無(wú)水乙醇為溶劑溶解的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80 mL，分別置于5 mL的容量瓶中，在80 ℃的水浴上蒸干后加入0.30 mL的新制5%的香草醛-冰醋酸溶液（稱取香草醛1.25 g，迅速用適量冰醋酸溶解轉(zhuǎn)入25 mL的容量瓶中定容，當(dāng)日使用）和1.00 mL的高氯酸后搖勻，于60 ℃的水浴保溫反應(yīng) 20 min后，用流水將其冷卻至室溫，再加入冰醋酸定量到10 mL，搖勻，同時(shí)作試劑空白，以空白對(duì)照和不同濃度水平的齊墩果酸對(duì)照品溶液分別在400～900 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)。在波長(zhǎng)為550 nm 處以試劑空白為參比，用1 cm的比色皿測(cè)定體系吸光度值（OD值）。以齊墩果酸的微克數(shù)為縱坐標(biāo)，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3），其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其回歸方程為：

y=0.021 1x+0.000 7，R2=0.998 4。

式中：y表示對(duì)照品中齊墩果酸的濃度（mg·mL-1）；x表示溶液在波長(zhǎng)為510 nm處的吸光值。從圖1中可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的線性關(guān)系良好（R2=0.998 4），可用作待測(cè)液中總?cè)祁惢衔锖康挠?jì)算公式。

圖1 齊墩果酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 A standard curve of oleanolic acid as reference substance

1.3.2 樣品測(cè)定

取干燥樣品粉末約0.1 g，精密稱定，置于具塞試管中，加入10 mL的無(wú)水乙醇提取48 h后，離心除去沉淀，吸取上清液0.2 mL于試管中，80 ℃水浴揮干。然后依照1.3.1中說(shuō)明的方法測(cè)定各樣品的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分別采用Excel 2007和SPSS 17.0等統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野鴉椿和圓齒野鴉椿三萜含量差異

野鴉椿和圓齒野鴉椿不同采樣部位的總?cè)祁惢衔锖咳鐖D2所示。由圖2可知，2014年8月從閩清縣下祝鄉(xiāng)1 022 m 高海拔樣地采集的野鴉椿葉片中三萜類化合物的含量為4.48%，比圓齒野鴉椿的高0.6%，其差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）；兩者枝條中三萜類化合物的含量，圓齒野鴉椿略高于野鴉椿，其差異并未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

圖2 野鴉椿和圓齒野鴉椿不同采樣部位的總?cè)祁?化合物含量Fig.2 Total riterpenoids contents in different sampling parts of E.japonica and E.konishii

2.2 不同部位總?cè)祁惢衔锏姆植记闆r

采集于不同試驗(yàn)地的圓齒野鴉椿其不同部位的總?cè)祁惢衔锖咳鐖D3所示。由圖3可知，2014年11月分別從農(nóng)大、清流和邵武采集的圓齒野鴉椿葉片中總?cè)祁惢衔锏暮糠謩e達(dá)到9.06%、7.14%與6.85%，均顯著高于其他采樣部位（P＜0.05）。采集于不同月份不同試驗(yàn)地的圓齒野鴉椿其不同部位的總?cè)祁惢衔锖咳鐖D4所示。由圖4可知，其不同部位的總?cè)祁惢衔锖?，也是葉片＞枝條，說(shuō)明葉片累積了更多的三萜類物質(zhì)。圓齒野鴉椿各部位的總?cè)祁惢衔锖坑筛叩降鸵来螢椋喝~片＞枝條＞果皮＞種子。

圖3 采集于不同試驗(yàn)地的圓齒野鴉椿其不同部位的總?cè)祁惢衔锖縁ig.3 Contents of total triterpenoids in different parts of E.konishii collected from different test plots

2.3 不同生長(zhǎng)區(qū)域?qū)A齒野鴉椿總?cè)祁惢衔锖康挠绊?/h3>

從圖3中還可看出，2014年11月采集的圓齒野鴉椿各個(gè)部位中總?cè)祁惢衔锖康亩嗌倩疽来螢椋恨r(nóng)大＞清流＞邵武。采集于農(nóng)大的圓齒野鴉椿，其葉片的總?cè)坪勘绕渲l的高164.91%；而采集于清流的葉片總?cè)坪勘绕渲l的高106.36%；此兩個(gè)數(shù)值之間存在明顯的差別，說(shuō)明在不同的栽培環(huán)境下三萜類物質(zhì)會(huì)在圓齒野鴉椿的某一部位富集。

當(dāng)進(jìn)入11月，即圓齒野鴉椿進(jìn)入果實(shí)成熟期而其旺盛生長(zhǎng)基本結(jié)束時(shí)，其葉片中總?cè)频暮烤笥?.85%，而其枝條中三萜的含量均在2.89%以上，但此時(shí)野鴉椿已落葉。

2.4 冬季低溫對(duì)圓齒野鴉椿總?cè)祁惢衔锖康挠绊?/h3>

從圖4中還可看出，2014年11月和2015年3月采集的圓齒野鴉椿樣品中總?cè)祁惢衔锏暮看嬖陲@著（P＜0.05）或極顯著水平的差異（P＜0.01）。除采集于農(nóng)大的枝條外，不同月份采集于其他3個(gè)地區(qū)的枝條和葉片的總?cè)祁惢衔锖?，均?月大于11月。三萜類物質(zhì)含量最多的可以提高172.91%，說(shuō)明冬季低溫更有利于圓齒野鴉椿中三萜類物質(zhì)的產(chǎn)生和積累。

2.5 各試驗(yàn)地的地理和氣候因素對(duì)圓齒野鴉椿總?cè)祁惢衔锖康挠绊?/h3>

各試驗(yàn)地的地理和氣候因素與圓齒野鴉椿各部位的總?cè)祁惢衔锖块g的相關(guān)系數(shù)見表2。表2表明，圓齒野鴉椿葉片中總?cè)祁惢衔锏暮颗c各試驗(yàn)地的海拔、年均氣溫、年降水量及年均無(wú)霜期之間均存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），其果皮中總?cè)祁惢衔锏暮颗c各試驗(yàn)地的海拔、年均氣溫、年降水量之間均存在極顯著的相關(guān)性，其種子中總?cè)祁惢衔锏暮颗c試驗(yàn)地的海拔、年均氣溫、年降水量之間均存在極顯著的相關(guān)性，而其枝條中總?cè)祁惢衔锏暮颗c試驗(yàn)地的海拔、年均氣溫、年降水量之間的相關(guān)性均不顯著，除枝條外，各部位總?cè)祁惢衔锖颗c海拔和年降水量這2個(gè)因素之間均表現(xiàn)出極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而其與年均氣溫之間卻表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)關(guān)系。

表2 不同栽培區(qū)域的地理和氣候因素與各部位中總?cè)祁惢衔锖块g的相關(guān)系數(shù)?Table 2 Correlation coefficients of geography and climate factors at different cultivation regions with content of total triterpenoids in each part

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

中藥材產(chǎn)地和采收時(shí)間均為影響藥材質(zhì)量的重要因素。吳雪松等人[13]的研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的生曬參和紅參藥材中總皂苷和單體皂苷量的差異較大，長(zhǎng)白、集安康美、撫松、靖宇4個(gè)產(chǎn)地的生曬參和紅參皂苷量的綜合評(píng)價(jià)值均較高，而有的產(chǎn)地沒(méi)有卻達(dá)到《中國(guó)藥典》中的規(guī)定；錢龍梁等人[14]發(fā)現(xiàn)，不同試驗(yàn)地其氣候等條件的差異對(duì)嫁接銀杏葉片中黃酮類化合物含量存在影響；劉和平等人[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)期水梔子果實(shí)中西紅花苷I、西紅花苷Ⅱ和梔子苷的含量存在顯著差異，每年的11—12月是最佳采果期；張杲等人[16]認(rèn)為，5—6月是采收連翹葉的最佳時(shí)期，因?yàn)?月連翹苷含量最高，6月連翹酯苷和蘆丁含量均最高；李曉英等人[17]的研究結(jié)果表明，8—9月藍(lán)莓葉中總黃酮的含量顯著高于其在5—6月的含量，且9月的總黃酮含量最高，說(shuō)明此期的抗氧化能力高于其他3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的；馬力等人[18]認(rèn)為，油茶籽適宜采摘期為霜降節(jié)前后。采收于不同產(chǎn)地的圓齒野鴉椿其不同部位的總?cè)坪看嬖谳^大差異，如采集于邵武的枝條其總?cè)坪窟_(dá)到7.89%，而農(nóng)大的只有2.03%；不同季節(jié)采收的圓齒野鴉椿其總?cè)坪恳泊嬖诓町悾?015年3月采集于3個(gè)樣地的圓齒野鴉椿其枝條（農(nóng)大枝條的除外）和葉片的總?cè)祁惢衔锖烤笥?1月采集的，經(jīng)過(guò)一個(gè)冬季的積累，其三萜含量最多可以提高172.91%。相關(guān)分析結(jié)果表明，除枝條外，圓齒野鴉椿葉片、果皮和種子中總?cè)祁惢衔锏暮颗c采樣地的海拔和降水量均呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與年平均溫度均呈正相關(guān)關(guān)系。

3.2 討 論

1）本研究存在的局限性。許多研究者[19-22]發(fā)現(xiàn)，隨著海拔高度的升高植物次生代謝產(chǎn)物也隨之增加，但是，本研究結(jié)果表明，總?cè)祁惢衔锏暮颗c海拔呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這是否是因?yàn)闃悠凡勺?個(gè)不同地區(qū)，除海拔影響外，還受不同地區(qū)的溫度、光照、濕度等因素的影響，對(duì)此有待于進(jìn)一步研究。

野鴉椿和圓齒野鴉椿均作野鴉椿藥材用，但兩者在形態(tài)和生長(zhǎng)習(xí)性上均存在一定的差異[4]：野鴉椿冬季會(huì)落葉，而圓齒野鴉椿屬常綠樹種；野鴉椿8月已處于果實(shí)成熟期，其生長(zhǎng)由旺盛期向落葉期轉(zhuǎn)變；而圓齒野鴉椿11月才進(jìn)入果實(shí)成熟期，其旺盛生長(zhǎng)期才開始結(jié)束。雖然野鴉椿葉片中總?cè)祁惢衔锏暮匡@著高于圓齒野鴉椿葉片中的含量，但其于11月已落葉；而11月不同栽培基地上的圓齒野鴉椿其三萜類化合物的含量均大于6.85%，且此時(shí)其枝條中三萜類化合物的含量也高于野鴉椿的；就掛果率而言，圓齒野鴉椿遠(yuǎn)高于野鴉椿，但其抗寒性卻不如野鴉椿，這就限制了圓齒野鴉椿向高海拔、高緯度地區(qū)的推廣種植。至于野鴉椿和圓齒野椿這些差異是如何形成的，如何增強(qiáng)圓齒野鴉椿的抗寒性，這些問(wèn)題都值得進(jìn)一步研究。

2）下一步研究的方向。針對(duì)上述問(wèn)題，一是進(jìn)行同一地區(qū)不同海拔梯度及相同海拔梯度不同地區(qū)的區(qū)域化栽培試驗(yàn)，深入探討影響圓齒野鴉椿三萜含量的氣候、環(huán)境因子，為圓齒野鴉椿適生環(huán)境的選擇提供科學(xué)依據(jù)；二是開展野鴉椿和圓齒野鴉椿雜交試驗(yàn)，選育出分布較廣、抗性較強(qiáng)、成熟期早、三萜含量高的抗寒新品種。