常振策，李忠旬，賈利娜，修江帆，國果,2，吳建偉,2***

(1.貴州醫(yī)科大學 貴州省普通高等學?，F(xiàn)代病原生物學特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學 寄生蟲學教研室，貴州 貴陽 550025)

家蠅生活在病原物富集的環(huán)境中，卻鮮見感染造成的傷害，并且能夠正常地完成生命活動，說明它具有強大的先天性免疫系統(tǒng)[1-4]。近年來，家蠅的先天免疫日益成為研究熱點。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白假絲酵母菌感染家蠅三齡幼蟲后可刺激家蠅C型凝集素基因(C-type lectin gene ofMuscadomestica，Mdctl)表達上調(diào)，認為該基因的表達產(chǎn)物在家蠅抗C.albicans感染過程中起作用[5]，但目前尚未見有關Mdctl基因的研究報道。為后續(xù)研究Mdctl基因在家蠅幼蟲抗C.albicans感染過程中的作用，本課題研究構(gòu)建家蠅Mdctl基因原核表達體系，獲得了純化的Mdctl基因表達產(chǎn)物，并進行了生物信息學分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物、質(zhì)粒和菌株 家蠅3齡幼蟲為本課題組飼養(yǎng)，克隆感受態(tài)E.coliDH5α和表達感受態(tài)E.coliBL21(DE3，北京全式金)，克隆載體pMD19-T購自Takara公司，表達載體pET-28a(+)購自Solarbio公司。

1.1.2主要試劑及儀器 Trizol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、原核表達相關試劑、氨芐青霉素購自Takara，SDS-PAGE蛋白電泳相關試劑、卡那霉素、羊抗小鼠IgG-HRP、Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody、Western-Blot相關試劑及耗材購自Solarbio，Ni-IDA Agarose His標簽蛋白純化試劑盒購自碧云天公司。核酸凝膠電泳裝置及成像系統(tǒng)、超聲破碎儀、電轉(zhuǎn)移裝置、蛋白凝膠電泳裝置均在貴州醫(yī)科大學現(xiàn)代病原生物學特色重點實驗室使用，Bio-Rad ChemiDoc MP和Nanodrop2000在貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學科研中心使用。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 運用DNAMAN V6.0軟件分析Mdctl基因的開放閱讀框、氨基酸序列和Mdctl蛋白信號肽位點，利用ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)分析Mdctl蛋白的理化性質(zhì)、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)分析Mdctl蛋白功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.2pMD19-T/Mdctl克隆載體和pET28a(+)/Mdctl表達載體的構(gòu)建 按照Trizol說明書提取家蠅三齡幼蟲總RNA，然后以總RNA為模板，按照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為Mdctl基因克隆時PCR擴增的模板?；蚪MDNA的除去反應條件為42 ℃ 2 min，然后冰浴5 min。逆轉(zhuǎn)錄反應條件為37 ℃ 20 min，85 ℃ 10 s，4 ℃ 10 s。利用Primer 5.0設計Mdctl基因的克隆引物(CkF、CkR)和Mdctl基因的表達引物(CbF、CbR)，由上海生工合成。Mdctl基因克隆上游引物(CkF)為ATGGGCGGTTACTTGGCCTC、游引物(CkR)為TCAAAACGAACTAACTATGACTGTTTTCGGGC；Mdctl基因表達上游引物(CbF)為CTAGCTAGCGACTATTATCCAACTGACAGATGGTG，下游引物(CbR)為CCCAAGCTTTCAAAACGAACTAACTATGACTGTTTTC。Mdctl基因PCR擴增的反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用DNA凝膠試劑盒純化回收，純化PCR產(chǎn)物和pMD19-T載體連接條件為16 ℃環(huán)境下作用12～16 h。將pMD19-T/Mdctl轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α克隆感受態(tài)細胞中，LB平板(含氨芐青霉素100 mg/L)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進行測序鑒定。以測序成功的pMD19-T/Mdctl克隆質(zhì)粒為模板，擴增Mdctl基因。Mdctl基因和pET-28a(+)載體雙酶切反應條件為37 ℃水浴酶切16～18 h,酶切產(chǎn)物用DNA凝膠試劑盒純化回收。酶切純化后Mdctl基因和pET-28a(+)載體連接條件為16 ℃環(huán)境下作用16～18 h。將pET28a(+)/Mdctl轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，LB平板(含卡那霉素50 mg/L)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進行測序鑒定。

1.2.3重組蛋白誘導表達、純化與鑒定 將測序鑒定的pET-28a(+)/Mdctl重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21/DE3感受態(tài)細胞中，LB平板(含卡那霉素50 mg/L)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進行測序鑒定，鑒定正確的單菌落再次接種于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 mg/L)中，37 ℃ 200 r/min振搖培養(yǎng)12 h后，以1 ∶50接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50 mg/L)中，37 ℃ 200 r/min振搖培養(yǎng)至OD600值為0.6時，分別以不同濃度的IPTG、溫度和培養(yǎng)時間進行誘導表達。在離心重懸濃縮后的培養(yǎng)物中加入5×SDS上樣緩沖液，瞬時離心后煮沸10 min，15%的SDS-PAGE凝膠電泳分析Mdctl蛋白的表達，確定重組蛋白的最佳誘導條件。超聲破碎誘導表達的菌體，分別取上清和沉淀進行15%SDS-PAGE凝膠電泳。按照蛋白純化試劑盒說明書，純化Mdctl重組蛋白，Western Blot鑒定Mdctl純化蛋白。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學分析

Mdctl基因ORF長為333 bp，編碼110個氨基酸(圖1)。Mdctl蛋白的信號肽為1～22位氨基酸，判定其為分泌型蛋白(圖2)。Mdctl蛋白理論分子量為13 131.42 Da，等電點約為4.49。Mdctl蛋白的Clect結(jié)構(gòu)域為23～110位氨基酸，屬于C型凝集素超家族(圖3)。

注：圖中方框內(nèi)為信號肽序列。圖1 Mdctl基因的開放閱讀框及氨基酸序列Fig.1 ORF of Mdctl and its amino acid sequence

圖2 Mdctl蛋白的信號肽分析Fig.2 Signal Peptide analysis of Mdctl protein

圖3 Mdctl蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain analysis of Mdctl protein

2.2 pMD19-T/Mdctl克隆載體和pET28a(+)/Mdctl表達載體的構(gòu)建

家蠅三齡幼蟲總RNA電泳檢測可見，18 S條帶較28S條帶明亮清晰，28S條帶暗淡模糊，說明提取的總RNA無顯著降解(圖4)。用Mdctl基因的克隆引物(CkF和CkR)對pMD19-T/Mdctl重組菌進行PCR擴增，電泳檢測顯示，其PCR產(chǎn)物在333 bp有一特異性條帶，與預期的片段大小相一致，經(jīng)測序鑒定表明Mdctl基因的克隆載體構(gòu)建成功(圖5)。用Mdctl基因的表達引物(CbF和CbR)對pET-28a(+)/Mdctl重組菌進行PCR擴增，電泳顯示，其PCR產(chǎn)物條帶與理論值完全吻合，經(jīng)測序鑒定表明Mdctl基因的表達載體構(gòu)建成功(圖6)。

注：M為DNA分子量標準，1為家蠅三齡幼蟲總RNA。圖4 總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis of total RNA

注：M為DNA分子量標準，1為pMD19-T/Mdctl重組菌落PCR。圖5 pMD19-T/Mdctl重組菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of recombinant colony PCR product of pMD19-T/Mdctl

注：M為DNA分子量標準，1為pET-28a(+)/Mdctl重組菌落PCR。圖6 pET-28a(+)/Mdctl重組菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of recombinant colony PCR product of pET-28a(+)/Mdctl

2.3 重組蛋白誘導表達、純化與鑒定

電泳結(jié)果顯示，在32 ℃，IPTG終濃度為0.6 mmol/L，誘導18 h時的蛋白表達量較高；Mdctl重組蛋白主要存在于沉淀中，為包涵體表達，其分子量約為16 kDa，與Mdctl蛋白兩端融合6×His標簽后的總分子量相一致(圖7)。以小鼠來源的抗His Tag單克隆抗體(1 ∶1 000)為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP(1 ∶4 000)為二抗，進行Western blot鑒定Mdctl純化蛋白，結(jié)果顯示，Mdctl純化蛋白與抗His Tag單克隆抗體特異性結(jié)合，出現(xiàn)一明顯免疫反應條帶，分子量(約16 kDa)正確，陰性對照在相應位置未出現(xiàn)該條帶，進一步確認其為目的蛋白(圖8)。

注：M為14.4～97.4 kDa蛋白Marker，1為pet28a(+)空載未誘導，2為pet28a(+)空載誘導，3為Mdctl重組未誘導，4為Mdctl重組誘導，5為破碎后上清，6為破碎后沉淀，箭頭所示為16 kDa目的條帶。圖7 Mdctl重組蛋白的誘導表達Fig.7 Induced expression of Mdctl recombinant protein

注：M為蛋白分子量標準，1為Mdctl純化蛋白，2為Mdctl純化蛋白的His標簽單抗檢測，3為陰性對照，箭頭所示為目的條帶。圖8 Mdctl純化蛋白的鑒定Fig.8 Identification of purified Mdctl protein

3 討論

家蠅具有極強的適應周圍惡劣環(huán)境的能力，這緣于它強大的先天免疫[1-4]。近年來，家蠅的先天免疫日益成為研究熱點。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白假絲酵母菌感染家蠅幼蟲后可刺激Mdctl基因表達上調(diào)，認為該基因的表達產(chǎn)物在家蠅抗C.albicans感染過程中起作用[5]。生物信息學分析顯示，Mdctl基因ORF全長333 bp，編碼110個氨基酸，信號肽切割位點為22～23位氨基酸之間，是分泌型蛋白。Mdctl的氨基酸序列中存在Clect(C型凝集素結(jié)構(gòu))結(jié)構(gòu)域，為23～110位氨基酸，而且還有特異性結(jié)合甘露糖的EPN/WND氨基酸基序，因此它屬于C型凝集素超家族，是一個新的家蠅C型凝集素。含有Ca2+依賴型的碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(CRD)的為經(jīng)典C型凝集素，非Ca2+依賴型的C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CTLD)的為非經(jīng)典C型凝集素[6]。C型凝集素在抗感染免疫中的主要功能有：作為一種調(diào)理素，參與免疫識別和對病原體的凝集吞噬作用；介導細胞之間的黏附、遷移和細胞之間的相互作用；參與止血、凝固、物質(zhì)運輸及創(chuàng)傷修復等作用；引發(fā)凝集素補體途徑的激活等[6-8]。為后續(xù)研究Mdctl基因表達產(chǎn)物的生物學功能，需要獲得足夠的Mdctl蛋白，但家蠅體內(nèi)的Mdctl蛋白含量少、分離提取困難、化學合成代價高，因此重組表達Mdctl蛋白是獲取Mdctl基因表達產(chǎn)物的最有效途徑。本研究通過構(gòu)建大腸桿菌原核表達系統(tǒng)[9-13]，誘導表達家蠅Mdctl重組蛋白，分析得出，在32 ℃，IPTG終濃度為0.6 mmol/L，誘導時間18 h時，Mdctl重組蛋白表達量較高。Mdctl重組蛋白主要存在于沉淀中，為包涵體表達。經(jīng)Western-Blot鑒定，Mdctl純化蛋白確實為目標蛋白。

鑒于目前家蠅凝集素的分子鑒定[14-17]和家蠅體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)功能[18-24]報道甚少，Mdctl作為家蠅體內(nèi)一種新的凝集素基因，在白假絲酵母菌刺激家蠅三齡幼蟲后高表達，本研究將進一步開展它對家蠅先天免疫調(diào)節(jié)作用的研究。