葛氏鱸塘鱧耐受完全結(jié)冰缺氧環(huán)境的能力及生理生化響應(yīng)

柴龍會(huì)，黃璞祎，暴旭

(東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

水體結(jié)冰是魚(yú)類(lèi)越冬時(shí)常常面臨的挑戰(zhàn)，特別是在高寒地區(qū)的淺水區(qū)域，水體常會(huì)因?yàn)闅鉁氐募眲∠陆刀皟鐾浮?。水體完全結(jié)冰會(huì)引起魚(yú)類(lèi)體液結(jié)冰、特別是會(huì)阻礙氣體交換，從而使魚(yú)類(lèi)處于完全缺氧的環(huán)境。關(guān)于魚(yú)類(lèi)適應(yīng)結(jié)冰水體的報(bào)道多集中于一些海水魚(yú)類(lèi)，如南極魚(yú)類(lèi)利用抗凍蛋白與冰的水合作用阻止冰晶進(jìn)入體內(nèi)并抑制體內(nèi)的冰晶生長(zhǎng)[1]，為魚(yú)體提供1～2 ℃的熱保護(hù)[2]，因此，可以在低于冰點(diǎn)的海水環(huán)境(-1.91 ℃)中生存。關(guān)于淡水魚(yú)類(lèi)耐受零下低溫的報(bào)道僅見(jiàn)于阿拉斯加黑魚(yú)Dalliapectoralis，其可以在-20 ℃的溫度下存活40 min，但是相關(guān)的耐受機(jī)制尚不清楚[3]。

葛氏鱸塘鱧Perccottusglenii主要分布于松花江流域，為了能夠在高寒地區(qū)的淺水區(qū)順利越冬，該魚(yú)可以在完全結(jié)冰缺氧的環(huán)境下生存數(shù)天，甚至在間歇“凍透”的水體中存活幾個(gè)月，因此，被當(dāng)?shù)貪O民稱(chēng)為“還陽(yáng)魚(yú)”。但是目前關(guān)于葛氏鱸塘鱧對(duì)水體完全結(jié)冰缺氧的耐受能力，以及對(duì)這種極端環(huán)境的生理生化響應(yīng)尚不清楚。為此，本研究中測(cè)定了葛氏鱸塘鱧在不同水體結(jié)冰溫度下的存活率，水體結(jié)冰前、水體完全結(jié)冰、魚(yú)體復(fù)蘇各階段的生理生化指標(biāo)，旨在為揭示淡水魚(yú)類(lèi)對(duì)完全結(jié)冰缺氧環(huán)境的耐受機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2017年11月中旬(自然水溫4 ℃左右)采用地籠在松花江濕地采集葛氏鱸塘鱧，選擇體質(zhì)量相近(全長(zhǎng)12.5 cm±1.8 cm、體質(zhì)量30.0 g± 2.7 g)的健康個(gè)體運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，冰箱內(nèi)(4 ℃)暫養(yǎng)7 d，期間不投餌，每天全量換水1次，暫養(yǎng)期間溶氧不低于6 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 耐受試驗(yàn) 耐受的結(jié)冰溫度分別設(shè)置為-2、-3、-4、-5 ℃，持續(xù)時(shí)間分別設(shè)為24、72 h。試驗(yàn)開(kāi)始后，將暫養(yǎng)的魚(yú)從4 ℃直接移入所設(shè)定溫度的冰箱中。降溫速率為1 ℃/h，至零度時(shí)水體存在一個(gè)結(jié)冰過(guò)程。由于設(shè)定溫度不同，各組結(jié)冰的時(shí)間為24～48 h。試驗(yàn)容器為5 L的透明食品保鮮盒，水的體積為4 L，每個(gè)容器內(nèi)放試驗(yàn)魚(yú)10尾。每個(gè)處理設(shè)置3組平行。溫度探頭放置在容器中間，并在靠近魚(yú)體的位置監(jiān)測(cè)溫度，在達(dá)到設(shè)定溫度和持續(xù)時(shí)間后，手工機(jī)械破冰，迅速將魚(yú)放入4 ℃水中，觀察其存活情況。為防止試驗(yàn)魚(yú)因低溫表現(xiàn)麻木引起的誤判，觀察時(shí)間持續(xù)4 h，以碰觸尾柄無(wú)反應(yīng)、鰓蓋無(wú)活動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)判斷死亡。

1.2.2 生理生化響應(yīng)試驗(yàn) 根據(jù)耐受試驗(yàn)結(jié)果，選擇存活率為100%的溫度-2 ℃和持續(xù)時(shí)間24 h的試驗(yàn)組進(jìn)行生理生化響應(yīng)試驗(yàn)。水體從表層開(kāi)始結(jié)冰至完全結(jié)冰的過(guò)程約為48 h。根據(jù)水體的凍融過(guò)程共設(shè)置5組，分別為水體結(jié)冰前(T1組，水溫0 ℃，溶氧 6 mg/L)、水體完全結(jié)冰24 h(T2組，冰溫度-2 ℃，溶氧約為0 mg/L)和魚(yú)體復(fù)蘇1 h(T3組)、24 h(T4組)和72 h(T5組)(機(jī)械破冰后魚(yú)被直接移入4 ℃水中復(fù)蘇，溶氧6 mg/L)。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放5尾魚(yú)，試驗(yàn)共75尾魚(yú)。試驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)溫度和溶氧。

1.2.3 生化指標(biāo)測(cè)定 將試驗(yàn)魚(yú)置于冰盤(pán)上立即處死、解剖，分別取其肝臟、心臟、肌肉、鰓和腦組織，于-80 ℃保存待測(cè)。肝臟和肌肉的糖原含量，各組織中的葡萄糖、乳酸、總蛋白含量，乳酸脫氫酶(LDH)活性分別采用南京建成相應(yīng)試劑盒測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)各階段不同組織中的生化指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛氏鱸塘鱧耐受水體結(jié)冰缺氧環(huán)境的能力

從表1可見(jiàn)：葛氏鱸塘鱧在-2 ℃持續(xù)24 h的存活率為100%，說(shuō)明其可以短時(shí)間耐受較溫和的完全結(jié)冰缺氧環(huán)境；隨著溫度降低和結(jié)冰時(shí)間的延長(zhǎng)，其存活率明顯下降，至-4 ℃時(shí)其24、72 h的存活率分別為30%和0，-5 ℃時(shí)其24 h的存活率為0。圖1為葛氏鱸塘鱧分別在水體完全結(jié)冰(圖1-A)、破冰(圖1-B)和復(fù)蘇階段(圖1-C)的狀態(tài)，從圖1-B可以看出，葛氏鱸塘鱧在冰中時(shí)的身體柔軟，碰觸尾柄有反應(yīng)，并未出現(xiàn)凍僵現(xiàn)象。

表1 不同溫度下葛氏鱸塘鱧的存活率(n=3)

Tab.1 Survival rates of Chinese sleeperPerccottusgleniiat different temperatures(n=3)

溫度/℃temperature持續(xù)時(shí)間/hduration存活率/%survivalrate-2247210080-324728060-42472300-5240

2.2 水體結(jié)冰前、完全結(jié)冰和魚(yú)體復(fù)蘇期葛氏鱸塘鱧的肝/肌糖原含量

從圖2可見(jiàn)：水體結(jié)冰前(T1)葛氏鱸塘鱧的肝糖原水平為102.66 mg/g prot，在結(jié)冰期(T2)急劇降低至20.45 mg/g prot，隨后在魚(yú)體復(fù)蘇1 h(T3)和24 h(T4)的肝糖原含量仍有小幅下降，直到復(fù)蘇72 h(T5)時(shí)肝糖原含量出現(xiàn)上升趨勢(shì)；葛氏鱸塘鱧在水體結(jié)冰期和復(fù)蘇期的肝糖原含量顯著低于水體結(jié)冰前的含量(P<0.05)，肌糖原含量的變化趨勢(shì)與肝糖原相似，但各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.3 水體結(jié)冰前、完全結(jié)冰和魚(yú)體復(fù)蘇期各組織的葡萄糖含量

從圖3可見(jiàn)：肌肉、鰓、腦和心臟中的葡萄糖含量水體結(jié)冰前(T1)均顯著低于水體結(jié)冰期(T2)和魚(yú)體復(fù)蘇期(T3～T5)(P<0.05)；肝臟中的葡萄糖含量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，峰值為4.75 mmol/g prot，出現(xiàn)在水體結(jié)冰期(T2)，在魚(yú)體復(fù)蘇期逐漸降低，至魚(yú)體復(fù)蘇72 h(T5)時(shí)葡萄糖含量降至1.87 mmol/g prot，且各階段葡萄糖含量的變化未達(dá)到顯著性水平(P>0.05)。從圖3還可以看出：鰓和腦組織中的葡萄糖含量在魚(yú)體復(fù)蘇1 h(T3)達(dá)到峰值后，隨復(fù)蘇時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；肌肉和心臟中的葡萄糖含量在魚(yú)體復(fù)蘇72 h(T5)時(shí)達(dá)到最大值，分別為2.31、1.41 mmoL/g prot。

2.4 水體結(jié)冰前、完全結(jié)冰和魚(yú)體復(fù)蘇期各組織的乳酸含量

從圖4可見(jiàn)：在水體結(jié)冰期(T2)和魚(yú)體復(fù)蘇期(T3～T5)，葛氏鱸塘鱧的腦和心臟組織中的乳酸含量顯著高于水體結(jié)冰前(P<0.05)，說(shuō)明完全結(jié)冰缺氧環(huán)境下，組織中的無(wú)氧糖酵解加強(qiáng)，代謝終產(chǎn)物乳酸含量增加；各階段的肌肉和肝臟中乳酸含量無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

2.5 水體結(jié)冰前、完全結(jié)冰和魚(yú)體復(fù)蘇期各組織的LDH活性

從圖5可見(jiàn)：試驗(yàn)各階段的葛氏鱸塘鱧各組織的LDH活性均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但仍可以看出，水體結(jié)冰期(T2)的鰓、腦和肝臟組織中的LDH活性較水體結(jié)冰前有不同程度的升高；復(fù)蘇期鰓、肌肉和心臟中的LDH活性最高值出現(xiàn)在魚(yú)體復(fù)蘇72 h(T5)，腦中的LDH活性最大值出現(xiàn)在魚(yú)體復(fù)蘇1 h(T3)，說(shuō)明腦在復(fù)蘇1 h的無(wú)氧糖酵解活動(dòng)最高，而鰓、肌肉和心臟中的無(wú)氧糖酵解活動(dòng)則在復(fù)蘇72 h最活躍。

3 討論

3.1 魚(yú)類(lèi)耐受環(huán)境結(jié)冰的能力

Evans等[2]研究發(fā)現(xiàn)，南極魚(yú)類(lèi)及一些生活在極地水域的海水魚(yú)類(lèi)可以在結(jié)冰的海水中生活，甚至可以在低于冰點(diǎn)的海水環(huán)境(-1.91 ℃)中生存。而關(guān)于淡水魚(yú)類(lèi)耐受環(huán)境結(jié)冰的報(bào)道相對(duì)較少。目前已知能夠耐受水體完全結(jié)冰環(huán)境的淡水魚(yú)類(lèi)是阿拉斯加黑魚(yú)Dalliapectoralis。阿拉斯加黑魚(yú)分布于阿拉斯加和白令島的淡水中，喜歡棲息在富含水生植物的湖泊、沼澤和池塘中，可以在完全結(jié)冰的環(huán)境下生存，甚至可以在-20 ℃存活40 min，但是60 min時(shí)會(huì)死亡[3]。本研究中葛氏鱸塘鱧在-2 ℃的冰中全部存活24 h，在-5 ℃的冰中24 h的存活率為0，破冰發(fā)現(xiàn)魚(yú)體柔軟并未出現(xiàn)僵硬的現(xiàn)象。這一結(jié)果說(shuō)明葛氏鱸塘鱧具有與阿拉斯加黑魚(yú)相似的耐受環(huán)境完全結(jié)冰的能力，但也無(wú)法耐受身體完全被凍僵。

需要強(qiáng)調(diào)的是，阿拉斯加黑魚(yú)和葛氏鱸塘鱧都可以在環(huán)境完全結(jié)冰下生存一段時(shí)間，但是無(wú)法如某些兩棲類(lèi)(如樹(shù)蛙Ranasylvatica)能夠耐受超過(guò)60%的體液結(jié)冰[4]。也就是說(shuō)，它們并非是耐凍種類(lèi)。但是它們進(jìn)化出的短期耐受環(huán)境完全結(jié)冰的能力，有助于其在極端天氣下引起的水體暫時(shí)“凍透”時(shí)存活。而且從棲息環(huán)境來(lái)看，葛氏鱸塘鱧與阿拉斯加黑魚(yú)有著共同的偏好，即喜歡棲息在富含水生植物的淡水淺水區(qū)。那么，這種水環(huán)境類(lèi)型是否有助于淡水魚(yú)類(lèi)進(jìn)化出耐受環(huán)境結(jié)冰的能力仍需要進(jìn)一步研究。

3.2 魚(yú)類(lèi)的抗凍保護(hù)劑

在冰凍或零下的環(huán)境中，大部分動(dòng)物會(huì)采取積累抗凍保護(hù)劑(cryoprotectants)的策略來(lái)降低冰點(diǎn)、提高體液滲透壓，從而解決體內(nèi)結(jié)冰、細(xì)胞內(nèi)冰核再結(jié)晶等問(wèn)題，常見(jiàn)的抗凍保護(hù)劑包括葡萄糖、蔗糖、甘油和抗凍(糖)蛋白等[5]。不同物種所選擇的抗凍保護(hù)劑種類(lèi)和數(shù)量均不相同。例如，同樣生活在結(jié)冰溪流中的兩種水生搖蚊幼蟲(chóng)Pseudodiamesabranickii和Diamesacinerella分別采用葡萄糖和蔗糖作為抗凍保護(hù)劑[6]。胡瓜魚(yú)Osmerusmordax則通過(guò)體內(nèi)積累甘油來(lái)適應(yīng)-1 ℃的低溫環(huán)境[7]。南極魚(yú)類(lèi)則主要以抗凍(糖)蛋白作為抗凍物質(zhì)[2]。兩棲類(lèi)和爬行類(lèi)則多選擇葡萄糖作為抗凍保護(hù)劑，如阿拉斯加越冬的樹(shù)蛙R.sylvaticus[8]和歐洲普通蜥蜴Lacertavivipara[9]都采用葡萄糖作為抗凍物質(zhì)。

本研究結(jié)果顯示，葛氏鱸塘鱧在水體結(jié)冰期和魚(yú)體復(fù)蘇期的肌肉、鰓、腦和心臟組織的葡萄糖含量均顯著高于水體結(jié)冰前；而在結(jié)冰期肝糖原含量顯著下降至結(jié)冰前的1/5左右，這說(shuō)明葛氏鱸塘鱧很可能通過(guò)分解肝糖原在組織中積累葡萄糖作為細(xì)胞保護(hù)物，從而提高魚(yú)體耐受水體結(jié)冰的能力。而在魚(yú)體復(fù)蘇期，肝臟、鰓和腦組織的葡萄糖含量均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是組織中的葡萄糖被重新轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，以肝糖原的形式儲(chǔ)存并為應(yīng)對(duì)下一次水體結(jié)冰做準(zhǔn)備。一些兩棲耐凍種類(lèi)也會(huì)采取類(lèi)似的耐受策略來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境中的反復(fù)低溫脅迫[4]。

3.3 魚(yú)類(lèi)對(duì)低溫缺氧環(huán)境的響應(yīng)

在完全結(jié)冰的水體中越冬需要適應(yīng)的另一個(gè)環(huán)境脅迫是缺氧。因?yàn)樗w完全結(jié)冰將魚(yú)體與外界空氣隔斷形成了一個(gè)極度缺氧的環(huán)境。在完全結(jié)冰的環(huán)境中，阿拉斯加黑魚(yú)的存活時(shí)間主要取決于其耐受缺氧的能力，其在水溫1 ℃條件下的封閉環(huán)境中，因?yàn)槿毖醵鵁o(wú)法生存超過(guò)24 h[3]。通常缺氧情況下，細(xì)胞的葡萄糖代謝從依賴(lài)氧的三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))轉(zhuǎn)換為不依賴(lài)氧的糖酵解代謝。例如，麥瑞加拉鯪魚(yú)Cirrhinusmrigala在缺氧72 h時(shí)糖酵解酶——己糖激酶、LDH和葡萄糖-6-磷酸酶的活性明顯增加[10]；印度鲇Clariasbatrachus在缺氧72 h時(shí)心臟和肌肉組織中的LDH活性顯著升高[11]，這說(shuō)明多數(shù)魚(yú)類(lèi)會(huì)通過(guò)提高糖酵解水平來(lái)適應(yīng)缺氧環(huán)境。

無(wú)氧糖酵解從每個(gè)葡萄糖分子中釋放2個(gè)ATP，而TCA循環(huán)能產(chǎn)生38個(gè)ATP，因此，缺氧細(xì)胞會(huì)通過(guò)增加葡萄糖的攝取來(lái)提升其生成ATP的能力。本研究中發(fā)現(xiàn)，水體結(jié)冰期葛氏鱸塘鱧在組織中大量積累葡萄糖也為無(wú)氧糖酵解提供了代謝底物。本試驗(yàn)過(guò)程中，葛氏鱸塘鱧所處的溶氧環(huán)境，從結(jié)冰前的6 mg/L逐漸下降至水體結(jié)冰24 h的0.22 mg/L，至完全結(jié)冰時(shí)溶氧接近0。在應(yīng)對(duì)水體結(jié)冰引起的缺氧環(huán)境中，葛氏鱸塘鱧的鰓、腦和心臟組織的糖酵解最終產(chǎn)物——乳酸的含量在水體完全結(jié)冰24 h時(shí)顯著升高，證實(shí)了其無(wú)氧糖酵解代謝增強(qiáng)。盡管葛氏鱸塘鱧各組織的LDH活性在結(jié)冰期和復(fù)蘇期有所升高，但均未達(dá)到顯著水平，這可能與其所處的溫度較低有關(guān)，而且葛氏鱸塘鱧在冰塊中停止一切運(yùn)動(dòng)(包括鰓蓋運(yùn)動(dòng))、所需能量降至最低水平，因此，LDH活性未出現(xiàn)顯著升高。