趙楠，曾端，和申，王強(qiáng)，胡滿基，張雷，陸偉，余一旻，沈一峰，李華芳

動(dòng)物模型及臨床研究[1]均表明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在抑郁障礙及抗抑郁療效中發(fā)揮著重要作用。大麻素作為重要的內(nèi)源性大麻素神經(jīng)遞質(zhì)，主要由脂脂肪酰胺水解酶(FAAH)代謝。rs324420 是FAAH基因上的一個(gè)功能單核苷酸多態(tài)性(SNP)，由于C到A堿基的突變，導(dǎo)致FAAH蛋白第129位脯氨酸→蘇氨酸的轉(zhuǎn)變，并由此損害FAAH的生理功能及活性[2]。經(jīng)上海市精神衛(wèi)生中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；本研究探討rs324420多態(tài)性與抑郁障礙及抗抑郁療效的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

抑郁障礙患者組：2009年8月至2015年12月在本中心門診或住院治療的18～65歲漢族抑郁障礙患者226例；均符合美國(guó)《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第4版(DSM-Ⅳ)抑郁障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)；漢密爾頓抑郁量表-17項(xiàng)(HAMD-17)≥18分。排除符合除抑郁障礙外的DSM-IV軸I診斷(包括精神分裂癥及雙相障礙等)、患有重大軀體疾病、嚴(yán)重自殺傾向、孕/哺乳期女性患者。在226例患者中，有7例未分型成功，遂219例納入研究。其中男68例，女151例；平均年齡(31.64±10.51)歲。對(duì)照組：同期招募健康志愿者411人，排除患有嚴(yán)重軀體疾病、本人或一級(jí)親屬有任何軸I診斷的精神疾病史。其中男158名，女253名；平均年齡(39.5±11.15)歲。兩組性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；年齡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.61,P<0.01)。

1.2 方法

1.2.1 患者的治療及臨床評(píng)估 患者入組后接受單一抗抑郁藥治療8周；其中服用帕羅西汀24例、度洛西汀13例、阿格美拉汀8例、文拉法辛13例及安非他酮45例。治療前及治療后2周，4周，6周，8周進(jìn)行HAMD-17評(píng)估，以治療后HAMD≤7為臨床緩解；HAMD減分率=(治療前總分-治療后總分)/治療前總分×100%。

1.2.2 FAAH基因rs324420多態(tài)性檢測(cè) 采用天根DNA分離試劑盒提取基因組DNA(天根);采用TaqMan assays(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)對(duì)rs324420進(jìn)行基因分型。標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法進(jìn)行擴(kuò)增，5 μl體積包含2.50 μl master mix,2.25 μl DNA和0.25 μl TaqMan探針。PCR 反應(yīng)過(guò)程：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s及60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后在ABI PRISM?7900檢測(cè)系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)上檢測(cè)基因型特異性熒光。rs324420基因分型成功率達(dá)98.9%。重復(fù)10%的樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，結(jié)果100%一致。

1.2.3 表達(dá)數(shù)量性狀基因座(eQTL)分析 將rs324420在BrainCloud(http://braincloud.jhmi.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行表達(dá)數(shù)量性狀基因座(eQTL)分析;包括237名健康對(duì)照者背外側(cè)前額葉皮質(zhì)(DLPFC)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 連續(xù)變量如年齡以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。分類變量如性別以百分比(%)表示，采用卡方檢驗(yàn)。使用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php) 及SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm) 在線軟件對(duì)兩組間的等位基因和基因型頻率進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡(HWE)分析。采用QUANTO軟件計(jì)算病例對(duì)照樣本的統(tǒng)計(jì)量大小,假設(shè)MDD的患病率是2%[3],OR值為1.5,最小等位基因頻率為0.188,則rs324420統(tǒng)計(jì)效能為83.15%。采用卡方檢驗(yàn)比較rs324420在緩解者與未緩解者之間的等位基因和基因型頻率分布。采用重復(fù)測(cè)量方差分析評(píng)估rs324420對(duì)HAMD總分及減分率的影響 (基因型為固定因素，治療周數(shù)為重復(fù)測(cè)量)，年齡和性別作為協(xié)變量。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05(雙側(cè)檢驗(yàn))被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者治療及分組結(jié)果

共有103例患者完成8周治療，其中5例基因分型失敗，遂98例患者納入分析。其中51例患者HAMD≤7分，歸入緩解亞組；47例歸入未緩解亞組。緩解亞組男21例，女30例；年齡為(37.02±12.51)歲；本次病程為(18.59±55.56)個(gè)月，總病程為(44.43±73.34)個(gè)月；HAMD基線評(píng)分為(23.29±2.79)分。未緩解亞組男23例，女24例；年齡為(32.38±9.76)歲；本次病程為(17.42±39.02)個(gè)月，總病程(48.15±46.66)個(gè)月；HAMD基線評(píng)分為(24.04±2.81)分。緩解亞組與未緩解亞組在性別、本次病程、總病程及HAMD基線評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；緩解亞組平均年齡顯著大于未緩解亞組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.04,P=0.043)。

2.2 各組rs324420多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

rs324420位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。病例組與對(duì)照組基因型及等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 緩解亞組與未緩解亞組rs324420多態(tài)性比較

緩解亞組與未緩解亞組間rs324420基因型頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；緩解亞組A等位基因頻率顯著高于未緩解亞組(χ2=4.28，P=0.039)。見表1。

2.4 患者組不同基因型間HAMD評(píng)分比較

運(yùn)用重復(fù)測(cè)量方差分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，rs324420不同基因型間HAMD總分及減分率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AA基因型攜帶者在2周、4周、6周和8周的HAMD總分均低于其他基因型，減分率均高于其他基因型,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.5 eQTL分析

表1 各組rs324420基因型及等位基因頻率比較(例數(shù)，%)

項(xiàng)目治療前治療2周治療4周治療6周治療8周HAMD總分AA23.17±2.3213.83±4.9610.00±4.348.17±3.765.50±3.62AC23.60±2.7215.70±5.0312.05±5.9210.10±5.868.25±6.53CC23.71±2.9016.36±5.7612.71±6.2010.28±6.568.64±6.71PAA-CC0.7620.1970.2020.3180.215PAC-CC0.9850.5030.5260.770.732減分率AA41.09±18.6556.83±18.5764.56±16.4576.58±15.60AC34.17±17.4549.48±23.0057.88±22.8665.27±26.39CC31.16±22.6646.69±23.9356.86±25.9963.82±26.65PAA-CC0.1610.1880.3180.19PAC-CC0.4040.4570.6910.713

注：PAA-CC表示HAMD總分及減分率在AA基因型與CC基因型兩兩比較時(shí)的P值； PAC-CC表示HAMD總分及減分率在AC基因型與CC基因型兩兩比較時(shí)的P值

eQTL分析發(fā)現(xiàn)rs324420基因CC型FAAH mRNA表達(dá)水平最高，其次為CA雜合子，而AA基因型FAAH表達(dá)水平最低，3組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討論

本研究探討FAAH 基因上的功能SNP rs324420與抗抑郁藥療效的關(guān)系。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)226例抑郁障礙患者與411名健康對(duì)照者FAAH 基因rs324420位點(diǎn)基因型及等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與文獻(xiàn)[4]報(bào)道結(jié)論一致。本研究98例完成單一抗抑郁藥8周治療的患者中，51例臨床緩解，47例為非緩解，緩解亞組與未緩解亞組間FAAH 基因rs324420位點(diǎn)基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但緩解亞組A等位基因頻率顯著高于非緩解亞組。不同基因型患者中，與AC、CC基因型比較，AA基因型患者在治療后2、4、6、8周時(shí)HAMD總分更低，減分率更高；推測(cè) FAAH 基因rs324420多態(tài)性可能與抗抑郁藥物的療效相關(guān)，A等位基因及AA基因型患者的抗抑郁療效較好。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[5-6]表明，阻斷內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生類似抑郁的行為。相反，給予大麻素受體 (CB1) 激動(dòng)劑或內(nèi)源性大麻素?cái)z取抑制劑或FAAH酶抑制劑可產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)，并能增強(qiáng)抗抑郁藥氟西汀對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的療效[7-9]。因此，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在一定程度上能調(diào)節(jié)情緒及行為，而該系統(tǒng)的增強(qiáng)可能對(duì)減輕抑郁癥狀有效。FAAH rs324420由于C到A堿基的突變導(dǎo)致了蘇氨酸到高度保守的脯氨酸的突變，且顯著降低FAAH酶活性近50%[2]，由此導(dǎo)致兩種重要的內(nèi)源性大麻素即大麻素(AEA)和花生四烯酰甘油(2-AG)的表達(dá)水平增加。本研究通過(guò)eQTL分析發(fā)現(xiàn)AA基因型的FAAH mRNA水平明顯低于C等位基因者，由此推測(cè)A等位基因可能通過(guò)下調(diào)FAAH mRNA的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)內(nèi)源性大麻素的表達(dá)并產(chǎn)生了較好的抗抑郁作用。因此推測(cè)rs324420 多態(tài)性的A等位基因?yàn)楸Ｗo(hù)基因型。

Maple等[10]研究發(fā)現(xiàn)FAAH 基因rs324420位點(diǎn)A等位基因攜帶者較CC基因型抑郁評(píng)分低且睡眠質(zhì)量更好。Shollenbarger等[11]研究也發(fā)現(xiàn)A等位基因攜帶者Beck抑郁評(píng)分較CC基因型低。這兩項(xiàng)研究與本研究結(jié)論一致。另外，Lazary等[12]的研究發(fā)現(xiàn)攜帶A等位基因與CC基因型相比，若童年創(chuàng)傷評(píng)分高時(shí)焦慮和抑郁得分也顯著增加。其主要原因可能與該研究得出的結(jié)論一致，即FAAH基因的遺傳變異合并早期童年創(chuàng)傷可能會(huì)使受試對(duì)象表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。

本研究樣本量相對(duì)較小，尤其是接受抗抑郁藥物治療的患者數(shù)較少，結(jié)果還需在更大樣本中進(jìn)行驗(yàn)證；本研究主要納入FAAH基因上功能SNP rs324420，并未覆蓋該基因上的所有多態(tài)性；抗抑郁藥的種類較多，可能是影響rs324420與療效相關(guān)性的混雜因素。

總之，F(xiàn)AAH基因rs324420多態(tài)性可能與抗抑郁藥物的療效相關(guān)，A等位基因及AA基因型攜帶者的抗抑郁療效較好。