核黃素在不同極性溶劑中的光譜特性研究

方梓秋，陳國慶*，吳亞敏

1. 江南大學理學院，江蘇 無錫 214122 2. 江蘇省輕工光電工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122

引 言

核黃素，是一種具有核糖醇側鏈的異咯嗪類衍生物，是人體中重要的氧化還原酶的輔酶。 越來越多的臨床研究表明，核黃素對肝臟和腎臟組織損傷有著顯著的恢復作用[1]。 同時在腫瘤治療的過程，核黃素也起到關鍵作用[2]。 所以，核黃素對人體的重要性不可忽視。 近年來，國內外學者對核黃素的光物理和光化學性質做了大量的研究。 如環(huán)境因素對核黃素熒光特性的影響、黃素中發(fā)色團的電子轉移活性問題[3]以及在BLUF(blue light sensing using flavin)發(fā)光材料領域的應用[4]都受到人們的廣泛關注。 此外，對于黃素類物質的量子化學計算也已得到初步研究[5]。

在實驗的基礎上，結合量子化學計算，研究溶劑對核黃素光譜特性的影響。 理論計算得到吸收峰和發(fā)射峰值，與實驗結果吻合較好； 分析核黃素前線分子軌道，了解受激躍遷方式； 計算不同溶劑中核黃素分子偶極矩值，從理論上闡明光譜變化與偶極矩之間的關系。 最后，考慮分子間氫鍵作用對核黃素光譜性質的影響。 從實驗和理論兩方面進一步了解核黃素的光學特性，其結果對核黃素在藥理學及發(fā)光材料等領域的研究提供一定的幫助。

1 實驗部分

核黃素(≥97.5%)購買于天津光復精細化工研究所； 溶劑分別為超純水、二甲基亞砜和三氯甲烷，有機溶劑均為國藥化學試劑有限公司提供的分析純試劑，分別配制成濃度為10 μg·mL-1的核黃素溶液。 實驗采用英國Edinburgh FLS920P型穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜儀，測量核黃素在上述三種溶劑中的穩(wěn)態(tài)吸收光譜、熒光光譜及時間分辨熒光光譜。 其中，測量熒光光譜時，激發(fā)波長為444 nm，光源為氙燈； 時間分辨熒光的測量利用系統(tǒng)中時間相關單光子計數(shù)技術，激發(fā)光源為中心波長374 nm的半導體激光器。 所有實驗均在室溫下完成。

2 量子化學計算

采用密度泛函理論中的B3LYP泛函，在6-31G(d, p)基組水平上對核黃素分子的基態(tài)幾何結構優(yōu)化，并通過頻率分析，優(yōu)化結構無虛頻，確認優(yōu)化的結構處于勢能面的能量最低點。 利用優(yōu)化好的結構，采用含時密度泛函理論，結合基于密度的溶劑化模型(the solvation model based on density, SMD)[7]，在B3LYP/6-311+G(d, p)水平上計算核黃素分子表面靜電勢及在不同溶劑中吸收和發(fā)射光譜。 全部計算均采用Gaussian 09程序完成。 分子表面靜電勢分析和弱相互作用分析均采用Multiwfn程序[8]完成。 結構相互作用的等值面圖使用VMD程序[9]繪制。

3 結果與討論

3.1 穩(wěn)態(tài)吸收和熒光光譜

圖1為核黃素在三種不同極性溶劑中的穩(wěn)態(tài)吸收光譜和歸一化熒光光譜。 可以發(fā)現(xiàn)，核黃素的主吸收峰幾乎不隨溶劑極性的改變而變化，峰值波長在443～445 nm范圍內； 而次級吸收峰隨溶劑變化的位移程度較大，表明核黃素次級吸收躍遷對溶劑極性更加敏感，與前人研究結果一致[10]。 同時，核黃素的熒光峰隨著溶劑極性的增大產生明顯的紅移現(xiàn)象。 這可能是由于溶劑與基態(tài)和激發(fā)態(tài)核黃素分子的相互作用程度不同引起。 表1中列出了核黃素在三種溶劑中主吸收峰和熒光峰的理論計算數(shù)據(jù)，與實驗值吻合較好。

圖1 核黃素在水、DMSO和三氯甲烷中的吸收光譜和歸一化熒光光譜

Fig.1Absorptionspectraandnormalizedfluorescencespectraofriboflavininwater,DMSOandchloroform

表1 核黃素在三種溶劑中的光譜信息

圖2 核黃素前線分子軌道(a)HOMO和(b)LUMO示意圖

Fig.2Viewofthefrontiermolecularorbitals(HOMOandLUMO)forriboflavinstructure

通過分子偶極矩解釋吸收光譜和熒光光譜位移程度不同的原因。 通過基態(tài)和激發(fā)態(tài)偶極矩的計算，說明溶質分子的電子激發(fā)和溶劑化作用引起電荷的重新分布，同時影響著溶質分子的偶極矩。 表2中列出核黃素在三種溶劑的基態(tài)和激發(fā)態(tài)偶極矩值計算結果。 由計算結果可知，激發(fā)態(tài)核黃素分子的偶極矩高于基態(tài)，溶劑與激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用也強于與基態(tài)分子的相互作用，使得吸收峰與熒光峰出現(xiàn)不同程度的變化。 隨著溶劑極性的增加，激發(fā)態(tài)偶極矩增大，溶劑與溶質的相互作用的增強，使得核黃素分子能級降低。 核黃素熒光發(fā)射躍遷對應于LUMO→HOMO軌道躍遷，HOMO和LUMO之間的能級間隙的ΔΕ直接影響著躍遷能。 核黃素在三種溶劑中的能帶間隙值ΔE列于表2中。 相比于非極性溶劑，激發(fā)態(tài)核黃素分子更容易被極性溶劑所穩(wěn)定，躍遷能量降低，熒光峰會隨溶劑極性增大發(fā)生紅移。

表2 核黃素在三種溶劑中的偶極矩(Debye)和能級間隙(ΔE)計算值

3.2 時間分辨熒光光譜

圖3 核黃素在374 nm激發(fā)下三種溶劑中的熒光衰減曲線

表3中列出了核黃素在水、DMSO和三氯甲烷中的熒光壽命。 由表3可以看出，核黃素最低激發(fā)態(tài)的壽命明顯地依賴溶劑極性，且核黃素在氫鍵給體溶劑中的熒光壽命要長于在非氫鍵給體溶劑中的熒光壽命。 壽命的延長可歸因于核黃素與氫鍵給體溶劑(水)之間的分子間氫鍵相互作用，阻礙了分子的運動，減少了分子在激發(fā)態(tài)的非輻射躍遷，從而熒光壽命得到延長。

表3 核黃素在三種溶劑中時間分辨熒光衰減信息

3.3 氫鍵作用

由3.2節(jié)時間分辨熒光光譜結果可知，核黃素分子在氫鍵給體溶劑中，不僅存在由溶劑參數(shù)引起的一般溶劑作用，還存在溶質和溶劑分子之間特殊的相互作用，如氫鍵。 因此在隱式溶劑模型的基礎上，在核黃素分子周圍引入水分子來研究它們之間的氫鍵相互作用及其對光譜的影響。

圖4 (a) 核黃素分子表面靜電勢分布； (b) 核黃素與水分子相互作用分析模型

核黃素分子表面含氧官能團能夠作為主要的吸附中心與水分子形成氫鍵，因此研究分子表面靜電勢[12]對于預測氫鍵形成位點具有重要的意義。 核黃素分子表面靜電勢分布如圖4(a)所示。 可以看出，異咯嗪環(huán)上的兩處羰基和核糖醇側鏈尾端的羥基等主要含氧官能團的氧原子由于孤對電子的存在，使得周圍呈現(xiàn)較大的負電勢，而氫原子周圍呈現(xiàn)較大的正電勢。 從上述吸收躍遷分析可知，電荷分布幾乎不涉及核糖醇側鏈，且靜電勢的極小值點出現(xiàn)在兩個羰基處，分別為-47.142和-47.512 kcal·mol-1。 說明兩羰基處更易與水分子發(fā)生以靜電力為主的氫鍵作用，因此基于之前的分析和對計算效率的考慮，構建了如圖4(b)所示的分子模型。 通過含時密度泛函理論，對該團簇模型的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜進行計算。 吸收峰值和熒光峰值分別為439.23和532.92 nm，計算結果均比僅通過隱式溶劑模型得到的結果更接近實驗值，說明在水中考慮氫鍵作用更加合理。

基于約化密度梯度函數(shù)(reduced density gradient，RDG)和電子密度(ρ)之間的關系，有研究開發(fā)出一種有效而便捷的方法來研究弱相互作用，稱為RDG方法[13-14]。 通過繪制RDG和ρ乘以電子密度Hessian矩陣的第二大本征值函數(shù)sign(λ2)之間的散點圖，并將ρ與本征值函數(shù)的乘積函數(shù)投影到RDG等值面上，可以在實空間中表征各種類型和強度的弱相互作用，研究對象主要是氫鍵(藍色)、范德華力(綠色)和位阻作用(紅色)。 散點圖上也出現(xiàn)若干垂直于橫坐標的“尖釘”(原文中稱為spike)，spike上的點正對應于弱相互作用區(qū)域。 圖5(a)和(b)分別為核黃素與水分子相互作用的填色散點圖以及顏色對應的RDG填色等值面圖。

圖5 (a) 核黃素與水分子填色散點圖； (b) 團簇模型RDG填色等值面圖

RDG填色等值面圖可以清晰地呈現(xiàn)出核黃素分子與水分子的相互作用區(qū)域。 核黃素兩處羰基的氧原子和水分子的氫原子之間，氨基上氫原子與水分子的氧原子之間均存在藍色等值面，表明存在氫鍵相互作用； 在散點圖中對應最左側藍色spike，橫坐標為-0.028 a.u.。 同時，兩個水分子之間存在淡藍、偏綠色的等值面，說明水分子二聚體以范德華作用和弱氫鍵的形式結合，對應散點圖中橫坐標為-0.022 a.u.的spike。 此外，兩處羰基與兩個水分子之間構成的環(huán)狀結構中還出現(xiàn)小片段的棕色、淡紅色等值面，表明分子間存在一定的位阻作用。 分析認為每個原子都會占據(jù)一定的空間，在以較強的相互吸引作用構成帶張力的結構時，會導致能量升高并產生斥力，所以體系需在位阻效應存在的情況下保持狀態(tài)穩(wěn)定。 由氫鍵為主導，與部分范德華力和位阻效應共同作用下所形成的環(huán)狀結構使得核黃素剛性得到增強，減小化學鍵的振動和轉動，降低非輻射躍遷的概率，熒光壽命因此延長。

4 結 論

通過實驗結合理論計算的方法，研究了溶劑對核黃素穩(wěn)態(tài)吸光譜、熒光光譜及時間分辨熒光光譜的影響。 應用密度泛函理論，計算了核黃素分子間相互作用僅使P的峰強發(fā)生變 在三種溶劑中的理論吸收和發(fā)射光譜，并與實驗測得光譜對比，吻合結果較好。 核黃素分子的電子激發(fā)及溶劑化作用影響分子偶極矩，從而導致吸收峰和熒光峰在不同溶劑中位移不同和熒光峰紅移； 并氫鍵供體溶劑中考慮分子間氫鍵作用的影響，氫鍵作用所形成的環(huán)狀結構提高核黃素分子的剛性，降低非輻射躍遷的幾率，熒光壽命延長。 該工作為研究其他黃素類物質在溶劑環(huán)境中的光學性質提供了思路。