近年來，由弧菌導(dǎo)致的水產(chǎn)動物病害頻繁發(fā)生，弧菌病害已成為海水養(yǎng)殖病害最重要的防治對象之一。蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)是一類專門以捕食細菌為生的寄生性細菌，由于它具有寄生和裂解許多魚類和水體致病性細菌的作用，在生物預(yù)防弧菌方面日益顯出其優(yōu)越性。水產(chǎn)用噬菌蛭弧菌優(yōu)良菌種的篩選獲得是其后續(xù)研究開發(fā)與應(yīng)用的重要保障，基于此，本實驗對本實驗室保存的一株海洋蛭弧菌BD-zr-11(分離自海水養(yǎng)殖池)進行了裂解譜分析和鹽度耐受性分析，旨在為該菌株在海水養(yǎng)殖中的潛在應(yīng)用提供一定科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

一、材料與方法

1.實驗材料

(1)海洋蛭弧菌BD-zr-11為本實驗室保存，分離自海水養(yǎng)殖池。

(2)宿主菌株共7株，分別為嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、鰻弧菌以及金黃色葡萄球菌，均為實驗室保存，分離自南美白對蝦肝胰腺、腸道或不同養(yǎng)殖環(huán)境水樣。

(3)營養(yǎng)肉湯、瓊脂購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

(4)儀器設(shè)備：震蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F160)、高速冷凍離心機(TGL-20bR)和細菌濁度儀(WGZ-XT)。

2.實驗方法

(1)裂解譜測定。將上述7種宿主菌分別接種于50毫升滅菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，置于37℃震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時，轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分；4℃、5000轉(zhuǎn)/分條件下離心30分鐘，收集菌體；用無菌生理鹽水洗滌兩次，離心收集菌體后用生理鹽水重新懸浮，細菌濁度儀測定比濁度，調(diào)整終濃度為1×1012CFU/毫升。將制備好的宿主菌菌懸液置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用雙層瓊脂平板法對公司蛭弧菌產(chǎn)品進行裂解譜分析，雙層瓊脂平板培養(yǎng)基下層為1.2%瓊脂、上層為0.8%瓊脂，每個細菌做3個平板，記錄噬菌斑出斑時間及噬菌斑數(shù)量。根據(jù)形成的噬菌斑數(shù)量判斷蛭弧菌對宿主菌侵染裂解作用。噬菌斑形成數(shù)量越多，表明蛭弧菌對某一宿主的侵染裂解效率越強。

(2)鹽度耐受性分析。參照程俊茗等人的方法，我們選擇0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%和3.5%共7個鹽度梯度進行試驗，采用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法，根據(jù)形成噬菌斑數(shù)量判斷蛭弧菌對鹽度的耐受性，并測定其最佳生長鹽度。

二、結(jié)果

1.裂解譜分析

由圖1可知，7種宿主菌中，蛭弧菌BD-zr-11對鰻弧菌、金黃色葡萄球菌雖然沒有表現(xiàn)出噬菌能力，但是對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌以及大腸桿菌這5種致病菌均具有良好的裂解能力，且表現(xiàn)為對嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌的裂解能力較對其他3株弧菌強。這與WILLIAMS HN、PINEIRO SA、RICE TD等人的研究報道一致。5株敏感菌均從48小時后開始出現(xiàn)噬菌斑，首先表現(xiàn)為點狀，隨著時間延長，噬菌斑逐漸擴大。

圖1 蛭弧菌BD-zr-11形成的噬菌斑

2.鹽度耐受性分析結(jié)果

由圖2結(jié)果可知，鹽度對蛭弧菌的生長有明顯的影響。蛭弧菌菌株對鹽度的耐受范圍是5～35，鹽度較低時，蛭弧菌的生長不良，蛭弧菌在鹽度15～35的范圍內(nèi)生長狀況良好，最適生長鹽度為25，數(shù)量級為104，是一株廣鹽性菌株。

圖2 不同鹽度對蛭弧菌BD-zr-11生長的影響

三、討論

由于滲透壓的關(guān)系，根據(jù)不同的養(yǎng)殖環(huán)境投放不同來源(海水或淡水)的蛭弧菌，才能保證最大限度地發(fā)揮蛭弧菌的效價。本實驗所用蛭弧菌BD-zr-11不僅對海洋致病菌副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌有裂解能力，對淡水致病菌嗜水氣單胞菌和大腸桿菌也有較好的裂解能力，具有一定的潛在開發(fā)利用前景，但在實際應(yīng)用中，其裂解能力可能會受到溫度、鹽度、環(huán)境污染物等多方面的影響。雖然該株蛭弧菌對鹽度耐受性較廣，但在鹽度為5及更低鹽度下，蛭弧菌的生長、繁殖受到抑制，導(dǎo)致其在淡水養(yǎng)殖上應(yīng)用受限。

另外，本文所選水產(chǎn)養(yǎng)殖常見致病菌種類有限，其噬菌范圍有待進一步的擴展驗證。該株蛭弧菌的實驗室應(yīng)用效果、對有益菌有無殺滅效果，在不同養(yǎng)殖品種、不同水質(zhì)條件、不同使用濃度下的臨床應(yīng)用研究有待進一步驗證。