劉健南，王小博

（佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系，廣東佛山528000）

丙烯酰胺（acrylamide）是一種白色晶體，易溶于水、乙醇、甲醇、丙酮等極性溶劑，作為生產(chǎn)聚丙烯酰胺和同聚體的中間體在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用[1-2]。丙烯酰胺是中等毒性的親神經(jīng)毒物，很容易被生物體的消化道、皮膚、肌肉或其他途徑吸收，引起急慢性中毒[3-4]，同時其具有生殖毒性[5]、致畸性和致癌性[6-7]。研究表明，一些油炸、焙烤的淀粉類食品中存在丙烯酰胺被檢出，因此，抑制食品丙烯酰胺的產(chǎn)生越來越受到重視。Oral 等[8]研究了7 種多酚和植物提取物對丙烯酰胺的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表兒茶素在化學(xué)模擬體系中對丙烯酰胺的抑制效果較好，抑制率可達(dá)74%。Zeng 等[9]發(fā)現(xiàn)在食品體系中添加VB能有效降低丙烯酰胺的生產(chǎn)。因此，天然抗氧化劑對食品體系中丙烯酰胺的抑制作用已成為研究的熱點。花青素，又稱作花色素，是一類水溶性的類黃酮化合物[10-11]，具有很強(qiáng)的抗氧化和抗自由基等功能[12-13]，食品添加劑聯(lián)合專家委員會建議每日允許攝入劑量值為0～2.5 mg/kg，其在食品加工中應(yīng)用廣泛，但是花青素用來抑制丙烯酰胺的形成鮮有報道。本文以黑枸杞花青素為研究對象，探討對曲奇餅干中丙烯酰胺形成的抑制作用，進(jìn)而確定合適的添加劑量，為食品加工中抑制丙烯酰胺的生成提供試驗依據(jù)，期望為后續(xù)開發(fā)一種高效抑制丙烯酰胺的食品添加劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：美國Sigma 公司；小麥粉、黃油、糖霜、飲用水、食用鹽：本地超市；黑枸杞花青素：佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系食品加工實驗室制備；島津LC-20AT 高效液相色譜儀：日本島津公司；FA1104A 電子天平：上海精天電子儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 曲奇餅干的制備

曲奇的制作方法參考楊轉(zhuǎn)紅等[14]，每組曲奇獨立焙烤2 次，并做空白。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 焙烤溫度的選擇

焙烤時間為12 min，花青素添加量為0.3 g/kg 的條件下，在焙烤溫度為 160、170、180、190、200 ℃時，測定并計算丙烯酰胺抑制率，并做空白試驗。

1.2.2.2 焙烤時間的選擇。

固定焙烤溫度為180 ℃，花青素添加量為0.3 g/kg，焙烤時間分別為 8、10、12、14、16 min 時，測定并計算丙烯酰胺抑制率，并做空白試驗。

1.2.2.3 花青素添加量選擇

固定焙烤溫度為180 ℃，焙烤時間為12 min 的條件下，花青素添加量為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg 時，測定并計算丙烯酰胺抑制率，并做空白試驗。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.06 軟件的Box-Behnken 設(shè)計原則設(shè)計試驗，并對焙烤條件進(jìn)行優(yōu)化。以焙烤溫度、焙烤時間、花青素添加量3 個因素作為試驗因素，檢測并計算丙烯酰胺的抑制率。選取一組曲奇餅干添加等量的原花青素做陽性對照。響應(yīng)面試驗因素和水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素和水平Table 1 Response interview test factors and levels

1.2.4 樣品處理與檢測

取適量曲奇餅干粉碎，稱取1.00 g 曲奇粉末于50 mL 離心管中，加入10.00 mL 1 g/L 的蟻酸溶液溶解，超聲振蕩 15 min，渦旋 10 min，離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min）。吸取離心管中部的水溶液2.00 mL，過0.22 μm的濾膜，高效液相色譜檢測丙烯酰胺含量。檢測條件：色譜柱：Hypersi10DS2-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；流動相，乙腈 ∶甲醇 ∶水=2 ∶5 ∶93（體積比）；柱溫為 40 ℃；流速：0.6 mL/min；分析時間：15 min。計算丙酰酰胺抑制率：

丙烯酰胺抑制率/%=[（AM0-AM）/AM0]×100

式中：AM0為空白對照組丙烯酰胺含量，μg/g；AM為試驗組丙烯酰胺含量，μg/g。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Origin 8.5 軟件繪圖，采用Design-Expert.V8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 焙烤溫度對丙烯酰胺抑制率的影響

焙烤溫度對丙烯酰胺抑制率的影響見圖1。

圖1 丙烯酰胺抑制率與焙烤溫度的關(guān)系Fig.1 Relationship between acrylamide-inhibition rate and baking temperature

由圖1 可知，隨著溫度升丙烯酰胺抑制率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。通過組內(nèi)比較，在170 ℃時，丙烯酰胺的抑制率顯著升高（P＜0.05），當(dāng)溫度為 180 ℃，丙烯酰胺抑制率變化極其顯著（P＜0.01）。因此，初步確定180 ℃為最佳的焙烤溫度。丙烯酰胺是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，而非終產(chǎn)物。在美拉德反應(yīng)中，丙烯酰胺的形成和消減是同時存在的，高溫更益于丙烯酰胺的消減。在焙烤初期，丙烯酰胺的形成大于消減，丙烯酰胺含量不斷上升，隨著焙烤的進(jìn)行，丙烯酰胺形成所需的反應(yīng)物減少，消減反應(yīng)逐漸超過形成反應(yīng)，丙烯酰胺含量呈現(xiàn)下降趨勢[15]。同時隨著溫度升高花青素降解也會加快，近一部導(dǎo)致丙烯酰胺抑制率降低。

2.1.2 焙烤時間對丙烯酰胺抑制率的影響

焙烤時間對丙烯酰胺抑制率的影響見圖2。

圖2 丙烯酰胺抑制率與焙烤時間的關(guān)系Fig.2 Relationship between acrylamide-inhibition rate and baking time

由圖2 可知，隨著焙烤時間的增加，丙烯酰胺抑制率也逐漸增加。通過組內(nèi)比較，當(dāng)焙烤時間為10、12 min 時，丙烯酰胺抑制率顯著升高（P＜0.05）；當(dāng)焙烤時間為14 min 時，丙烯酰胺抑制率升高極其顯著（P＜0.01）。但是隨著焙烤時間進(jìn)一步延長，丙烯酰胺抑制率又呈下降趨勢。黑枸杞花青素作為一種天然抗氧化物，在長時間高溫加熱條件下本身的性質(zhì)會發(fā)生變化，使其抑制作用發(fā)生改變[16]。因此，初步確定14 min為最佳的焙烤時間。

2.1.3 花青素添加量對丙烯酰胺抑制率的影響

花青素添加量對丙烯酰胺抑制率的影響見圖3。

圖3 丙烯酰胺抑制率與花青素添加量的關(guān)系Fig.3 Relationship between acrylamide-inhibition rate and the amount of anthocyanin added

如圖3 可知，花青素添加量與丙烯酰胺的抑制率均呈非線性變。當(dāng)花青素添加量為0.2 g/kg 時，丙烯酰胺抑制率增加極其顯著（P＜0.01），此時達(dá)到最大。研究表明，丙烯酰胺生成量與抗氧性有密切關(guān)系，抗氧化性強(qiáng)，有利于花青素抑制丙烯酰胺產(chǎn)生[17]。同時抗氧化劑并不能有效破壞或抑制丙烯酰胺的合成，有的甚至還能促進(jìn)丙烯酰胺的合成作用；但它們的氧化產(chǎn)物可以通過直接破壞丙烯酰胺或其合成的前體物質(zhì)天冬酰胺而起到抑制作用[10]。花青素作為一種抗氧化劑，其也符合抗氧化悖論，即濃度增大到一定程度時，抗氧化能力反而減小，因此對丙烯酰胺的抑制作用也隨之減弱[18]。因而，初步確定花青素最佳添加量為0.2 g/kg。

2.2 響應(yīng)面分析

由單因素試驗結(jié)果可以看出，黑枸杞花青素對曲奇餅干中花青素的抑制效果取決于焙烤溫度、焙烤時間、花青素添加量的選擇以及各提取條件間的相互組合[19]。采用響應(yīng)面法優(yōu)化抑制曲奇餅干丙烯酰胺的最佳條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以焙烤溫度、焙烤時間、花青素添加量為自變量，丙烯酰胺抑制率為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.06 軟件根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計原則設(shè)計試驗，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.2.1 擬合模型

根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計原則，Design Expert 8.06軟件設(shè)計了17 組試驗，被用于優(yōu)化抑制丙烯酰胺生成的條件，試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and results

續(xù)表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Continue table 2 Response surface analysis scheme and results

采用方差分析（ANOVA），二階多項式模型來計算預(yù)測的響應(yīng)，公式如下：

Y=68.41+6.82A+2.54B+3.91C-2.74AB+0.27AC+2.14BC-10.21A2-14.79B2-9.49C2，其中，R2=0.990，表明方程可信度較好，能夠準(zhǔn)確地分析和預(yù)測抑制丙烯酰胺生成的條件。

采用F 檢驗、P 值來評價模型方程的統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn) 值和P 值用來檢驗每個系數(shù)的顯著性。F 越大，P 值越小，則相應(yīng)的系數(shù)越顯著。丙烯酰胺抑制率模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 丙烯酰胺抑制率模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of model for inhibition rate of acrylamide

根據(jù)方差分析結(jié)果，模型的 F 為 77.35，P＜0.000 1，這表明模型極顯著。系數(shù) A、B、C、AB、A2、B2、C2均顯著（P＜0.05），AC、BC 系數(shù)并不顯著（P＞0.05）。決定系數(shù)（R2=0.990）的值接近于1，表明預(yù)測值與實際值具有有效的關(guān)聯(lián)性。調(diào)整后的決定系數(shù)（R2adj=0.977 2）也接近1，這表明試驗值可以由模型來預(yù)測。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面模型是表達(dá)不同參數(shù)對丙烯酰胺抑制效果的最好方式。三維（3D）響應(yīng)面作為回歸方程的一個重要組成部分，可以描述兩個變量之間的相互作用，并確定它們的最優(yōu)水平[13]。它提供了一個有效的方法來反映響應(yīng)值與各變量試驗水平間的關(guān)系及兩個變量間相互作用的類型[20]。圖的形狀可以反應(yīng)變量之間的相互作用是否顯著[13]。圖4 顯示焙烤溫度、時間、花青素添加量之間的相互作用對丙烯酰胺抑制率的影響。

圖4 不同因素對丙烯酰胺抑制率的影響Fig.4 The influence of different factors on the inhibition rate of acrylamide

結(jié)合方差分析，可以知道焙烤溫度－時間之間的相互作用丙烯酰胺抑制率影響顯著（圖4A）；花青素添加量－焙烤溫度之間的相互作用丙烯酰胺抑制率影響顯著（圖4B）；花青素添加量－焙烤時間之間的相互作用丙烯酰胺抑制率影響顯著（圖4C）。由此可知，各因素之間存在明顯的交互作用。采用花青素抑制曲奇中丙烯酰胺時，溫度不宜過高，時間不宜過長。

回歸分析結(jié)果與3 個因素對響應(yīng)值的影響以及各因素之間的交互影響相吻合。在響應(yīng)面最高點和等高線所選范圍內(nèi)存在極值，即為最優(yōu)點。綜上分析，丙烯酰胺抑制率最高時（69.46%），焙烤溫度為184.76 ℃，焙烤時間為12.32 min，花青素添加量為0.32 g/kg。根據(jù)實際試驗條件，調(diào)整條件為焙烤溫度為185 ℃，焙烤時間為12 min，花青素添加量為0.32 g/kg。在此條件下，重復(fù)5 次，丙烯酰胺抑制率為69.34%，接近預(yù)測值69.46%，證明擬合響應(yīng)面模型的適用性。研究表明原花青素可以有效的抑制食品中丙烯酰胺的產(chǎn)生[21]，在此條件下加入等量的原花青素，餅干中丙烯酰胺抑制率為69.34%。因此，響應(yīng)面設(shè)計更好地預(yù)測了曲奇中丙烯酰胺抑制效果，可信度高。表明花青素能夠有效抑制曲奇中丙烯酰胺的產(chǎn)生。

3 結(jié)論

研究表明，黑枸杞花青素可以有效抑制丙烯酰胺的產(chǎn)生。方差分析結(jié)果表明，曲奇中丙烯酰胺抑制效果受焙烤時間、溫度，以及花青素添加量影響較大。通過響應(yīng)優(yōu)化及根據(jù)實際試驗條件，抑制丙烯酰胺產(chǎn)生最佳條件為焙烤溫度為185 ℃，焙烤時間為12 min，花青素添加量為0.32 g/kg，在此條件下丙烯酰胺抑制率可達(dá)到69.34%。