乳品中致敏蛋白的檢測(cè)與控制研究進(jìn)展

翁俊杰，艾蓉，湯旭翔，傅玲琳，王彥波，劉繼超，劉福奇，*

（1.浙江工商大學(xué)，浙江杭州310018；2.北京三元食品股份有限公司，北京100163）

食物過敏目前已成為全球共同關(guān)注的健康安全問題之一，在過去的十幾年里，食物過敏影響了近8%的成人和5%的兒童[1]。前期研究表明，牛奶、雞蛋、大豆、花生、小麥、堅(jiān)果類、魚及甲殼類是主要的8 種致敏食物，據(jù)統(tǒng)計(jì)將近90%的食物過敏都是由這8 種食物引起的[2]。近些年，隨著乳品的普及，由乳品引發(fā)的過敏問題也隨之增多，在嬰幼兒中牛乳過敏的比例高達(dá)2%～6%[3]。此外，隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，除了乳品本身，乳品中蛋白質(zhì)還可以作為原料或者輔料用于制作其他食品，如利用乳清蛋白的持水性、攪打起泡性、乳化性等特性制作面包、餅干、黃油、冰淇淋等食物。因此導(dǎo)致乳品中致敏蛋白也會(huì)存在于其他食物中，進(jìn)而產(chǎn)生致敏隱患。因此如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)乳品中的致敏蛋白以及在加工過程中如何更好地控制和降低致敏蛋白的含量顯得至關(guān)重要，對(duì)減少乳品過敏現(xiàn)象的發(fā)生和降低其對(duì)人體健康的危害具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文簡(jiǎn)要地綜述了近年來(lái)乳品中致敏蛋白檢測(cè)和控制方法的研究進(jìn)展及發(fā)展趨勢(shì)。

1 乳品中致敏蛋白的檢測(cè)

1.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）已廣泛應(yīng)用于乳品等食物過敏原檢測(cè)，具有高準(zhǔn)確度和高靈敏度且操作簡(jiǎn)單便捷，可以用于快速、準(zhǔn)確地定性和定量分析乳品中過敏原。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 法和雙抗體夾心ELISA 法是目前用于牛奶過敏原檢測(cè)的兩種主要技術(shù)方法?？贵w的特異性和效價(jià)對(duì)ELISA 的檢測(cè)結(jié)果具有重要影響，雙抗體夾心ELISA 法結(jié)合了單克隆抗體特異性強(qiáng)和多克隆抗體靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，研究證實(shí)可以達(dá)到更好的檢測(cè)效果[4]。李亞璞等[5]選擇新西蘭大白兔和BALB/c 小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用牛乳中的β-乳球蛋白抗原分別對(duì)其免疫制備抗體，通過抗體純化和特異性測(cè)定，制備出具有高特異性和高效價(jià)的鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體。該雙抗體夾心ELISA 得到的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較高，且與食品中的其他致敏蛋白沒有發(fā)生顯著交叉反應(yīng)。He等[6]使用兔抗β-乳球蛋白多克隆抗體開發(fā)夾心ELISA法，β-乳球蛋白檢測(cè)的線性范圍為31.25 ng/mL～8 000 ng/mL，具有高度的靈敏度和可靠性且其最低檢測(cè)限能達(dá)到1.96 ng/mL。該法準(zhǔn)確檢測(cè)了乳品中β-乳球蛋白的含量，且樣本中的β-乳球蛋白平均回收率為104.25%，可用于檢測(cè)乳品中的β-乳球蛋白。當(dāng)然，ELISA 法也存在不足之處，目前尚無(wú)法解決含有多種過敏原的乳品等復(fù)雜樣品，且受環(huán)境的影響較大，存在潛在交叉污染問題。此外食品加工過程中的熱處理、酶解等工藝都可能在一定程度上改變?nèi)槠返仁澄镏械牡鞍捉Y(jié)構(gòu)，從而改變抗體結(jié)合部位，干擾致敏蛋白的ELISA 檢測(cè)結(jié)果。

1.2 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）是一種以高壓直流電場(chǎng)作為驅(qū)動(dòng)力和毛細(xì)管作為分離通道的液相分離技術(shù)，目前已經(jīng)應(yīng)用于乳品中蛋白致敏原的檢測(cè)。研究表明，牛乳中主要的蛋白，包括乳清蛋白、乳球蛋白、酪蛋白及其主要降解產(chǎn)物para-κ-酪蛋白均可通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳法進(jìn)行鑒別。Omar 等[7]通過毛細(xì)管電泳法成功鑒定和定量了駱駝奶中的乳清蛋白質(zhì)和酪蛋白，其得到的檢測(cè)圖譜與凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）一致，但毛細(xì)管電泳法分辨率更高、更加易于操作且成本相對(duì)低廉。Trimboli 等[8]借助于CE法，對(duì)羊奶和牛奶的可識(shí)別且獨(dú)特的蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析，成功定量了羊奶、牛奶混合物中的單一成分含量。但是傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳法存在電泳過程中產(chǎn)生樣品吸附等問題，從而造成該方法的靈敏度和分離性能下降。為了解決這一問題，劉一等[9]通過對(duì)試驗(yàn)條件和樣品處理的完善優(yōu)化，發(fā)明了一種快速高效的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法。在 25 ℃，30 kV 電壓，pH=7.0 的磷酸鹽緩沖液，壓力進(jìn)樣5 kPa，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm 等的試驗(yàn)條件下，實(shí)現(xiàn)了基線分離，經(jīng)過試驗(yàn)優(yōu)化后檢測(cè)限也大大降低，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢出限分別達(dá)到了3.0 mg/mL 和12 mg/mL，從而解決了電泳過程中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的樣品蛋白吸附問題。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)的靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以用于痕量或成分復(fù)雜的乳品過敏原分析。關(guān)瀟等[10]根據(jù)已知過敏原α-乳白蛋白的基因序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物，用該特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后其靈敏度可達(dá)0.04 ng DNA，然后用該P(yáng)CR 法成功檢測(cè)添加在其他食品中的乳白蛋白。研究表明，普通PCR 得到的檢測(cè)結(jié)果需要電泳驗(yàn)證才能確定，而且在試驗(yàn)過程中受環(huán)境影響較大，易發(fā)生交叉污染，影響其檢測(cè)結(jié)果，實(shí)時(shí)熒光PCR 解決了上述問題。賈敏等[11]針對(duì)β-乳球蛋白基因序列設(shè)計(jì)了探針，并基于該探針開展了乳品中β-乳球蛋白實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，變異系數(shù)在5%以內(nèi)，具有快速高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。Se?kin 等[12]通過實(shí)時(shí)PCR研究了90 種不同的奶酪，確定了奶酪生產(chǎn)中所使用的牛奶的數(shù)量和來(lái)源，且該實(shí)時(shí)PCR 已多用于鑒定乳制品來(lái)源的動(dòng)物物種，為后續(xù)過敏原的研究和檢測(cè)提供了一定借鑒。雖然目前關(guān)于實(shí)時(shí)PCR 在乳品檢測(cè)中應(yīng)用的報(bào)道較少，但它可以彌補(bǔ)普通PCR 的不足，是一種具有前瞻性的檢測(cè)技術(shù)。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同樣是在乳品過敏原檢測(cè)方面應(yīng)用較多的方法，可以實(shí)現(xiàn)過敏原的多重定量[5]。Heick 等[13]提出了一種基于液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)模式，可以同時(shí)檢測(cè)7 種過敏原的方法。檢測(cè)濃度范圍為10 μg/g 至 1 000 μg/g，其中牛奶檢測(cè)濃度可低至10 μg/g，證明基于液質(zhì)聯(lián)用的方法是過敏原篩選的有效工具。袁明美等[14]開發(fā)了用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測(cè)定乳品中β-乳球蛋白含量的辦法，靈敏度和準(zhǔn)確度都較高，檢測(cè)限可達(dá)到1 nmol/L。牛奶酪蛋白是葡萄酒澄清過程中常用的蛋白質(zhì)，也是葡萄酒的主要過敏原，存在致敏隱患。Tolin 等[15]用十二烷基硫酸鉀和十二烷基硫酸鈉進(jìn)行蛋白預(yù)處理，并借助于LC-MS/MS 法準(zhǔn)確檢測(cè)鑒定了殘留的澄清蛋白質(zhì)濃度，分析快速準(zhǔn)確，有效地克服了傳統(tǒng)免疫學(xué)方法的局限性。Ji 等[16]開發(fā)了基于液相色譜-串聯(lián)多反應(yīng)檢測(cè)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem multiple reactions-monitoring，mass spectrometry，LC-MRM/MS）確認(rèn)和量化食品中牛奶過敏原的方法。在37 ℃，16 h 的反應(yīng)條件下用酶水解α-乳白蛋白（α-La）、αs1-酪蛋白（αs1-CN）、β-乳球蛋白（β-Lg），再通過使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離-串聯(lián)時(shí)間飛行質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization with tandem time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF MS）對(duì)其進(jìn)行標(biāo)識(shí)驗(yàn)證，α-La，β-Lg 和 αs1-CN的線性范圍分別為 0.97 μg/mL～31.25 μg/mL，0.48 μg/mL～31.25 μg/mL 和 0.48 μg/mL～31.25 μg/mL。蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為質(zhì)譜在蛋白水平和肽段水平的定性、定量分析提供了可能。此外，多反應(yīng)檢測(cè)在質(zhì)譜的廣泛應(yīng)用使得質(zhì)譜的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都顯著提高。

2 乳品中致敏蛋白的控制

2.1 熱處理

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象經(jīng)熱處理會(huì)發(fā)生改變形成聚合物，這些聚合物可以在一定程度上掩蓋致敏蛋白表位而使蛋白致敏性降低。Fuente 等[17]和Considine 等[18]研究發(fā)現(xiàn)熱處理會(huì)導(dǎo)致α-乳清蛋白和β-乳球蛋白發(fā)生聚集，且隨著處理溫度的升高，大分子量聚集體的數(shù)量不斷增加，使蛋白潛在致敏性顯著下降。目前在乳品中廣泛使用的熱處理方式有超高溫瞬時(shí)殺菌、高溫短時(shí)巴氏殺菌和二次殺菌。Mehr 等[19]研究表明，70 名對(duì)牛乳有過敏反應(yīng)的兒童攝入經(jīng)強(qiáng)加熱處理的牛乳，結(jié)果只有19 名兒童顯現(xiàn)過敏癥狀，證實(shí)了熱處理法確實(shí)可降低致敏蛋白的致敏性。

研究表明，雖然經(jīng)過熱處理后會(huì)降低乳品致敏性，但在處理過程中乳品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味特性也會(huì)發(fā)生不同程度的變化。而且由于在熱處理過程中存在化學(xué)鍵斷裂和重新形成，可能產(chǎn)生新的抗原表位；或經(jīng)過熱處理可能會(huì)使蛋白質(zhì)內(nèi)部的抗原表位暴露，這些都有可能增強(qiáng)其致敏性。蛋白的熱敏性不同和處理方法的不同也會(huì)對(duì)處理結(jié)果產(chǎn)生影響。Xu 等[20]對(duì)牛奶蛋白質(zhì)濃縮物進(jìn)行熱處理研究發(fā)現(xiàn)，α-乳白蛋白經(jīng)過65 ℃～100 ℃的熱處理后其潛在致敏性有顯著的下降，但是β-乳球蛋白的抗原性在85 ℃和100 ℃下熱處理25 min 后迅速增加，與未處理的樣品相比，熱處理后β-酪蛋白的潛在致敏性顯著增加。費(fèi)爽雯等[21]研究了不同溫度的熱處理對(duì)牛乳中過敏原蛋白致敏性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過加熱處理的α-乳白蛋白與免疫球蛋白G（IgG）的結(jié)合能力相比于未處理的有顯著增強(qiáng)，β-乳球蛋白的抗原性隨著熱處理強(qiáng)度的增加反而逐漸降低。綜上所述，乳品中致敏蛋白的致敏性受熱處理方式的影響，熱處理的效果與處理溫度、時(shí)間、蛋白質(zhì)的內(nèi)部特征以及物化條件等有關(guān)，因此在研制低過敏性乳制品過程中，需要優(yōu)化全產(chǎn)業(yè)鏈中熱處理相關(guān)條件，避免引起抗原性增強(qiáng)的情況。

2.2 糖基化作用

蛋白質(zhì)的糖基化作用是碳水化合物與蛋白分子上的氨基通過共價(jià)鍵發(fā)生結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)（包括美拉德反應(yīng)）。研究表明，食品中的蛋白質(zhì)經(jīng)過糖基化修飾可以改善蛋白分子的乳化性、抗氧化性、熱穩(wěn)定性、起泡性等功能特性，而且可以修飾改變蛋白分子上的抗原表位使其致敏性降低。Wu 等[22]先將β-乳球蛋白分別與低聚異麥芽糖（isomaltooligosacharides，IMO）、低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）和低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS） 進(jìn)行反應(yīng)，再借助于ELISA 法分析反應(yīng)前后β-乳球蛋白與免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）和免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）結(jié)合能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過糖基化處理的β-乳球蛋白的抗原性有明顯降低。María 等[23]研究同樣發(fā)現(xiàn)了酪蛋白糖巨肽（casein glycol-macro-peptide，CMP）可以減少β-乳球蛋白消化產(chǎn)物的表位從而使牛乳中β-乳球蛋白的潛在致敏性降低。

研究表明，美拉德反應(yīng)中的反應(yīng)條件如反應(yīng)底物的質(zhì)量比、溫度、時(shí)間等均會(huì)影響過敏原致敏性的降低程度。Li 等[24]研究在不同美拉德反應(yīng)條件下乳清蛋白分離物中β-乳球蛋白致敏性的變化，并優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在最佳美拉德反應(yīng)條件下通過用寡聚體異構(gòu)體糖基化，β-乳球蛋白的抗原性從272.4 μg/mL 降至 30.99 μg/mL，有效降低了約 88.6%。Cardoso 等[25]通過用不同糖類誘導(dǎo)各個(gè)乳蛋白的美拉德反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于所有的蛋白質(zhì)-糖類組合，α-乳清蛋白比β-乳球蛋白更具反應(yīng)性。美拉德反應(yīng)雖然可以有效降低致敏性，但由于難以控制反應(yīng)過程中的復(fù)雜變化，可產(chǎn)生一些副產(chǎn)物影響乳品的營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味，甚至危害人體健康，所以在低敏乳品開發(fā)時(shí)應(yīng)充分考慮其安全特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，需要嚴(yán)格控制美拉德反應(yīng)的條件以避免有害物質(zhì)的生成。

2.3 酶水解

胃蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、中性蛋白酶等是目前普遍用于乳品致敏蛋白水解的酶類。這些蛋白酶通過對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解使其分子量減少，同時(shí)還會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子上的一些與過敏反應(yīng)相關(guān)的線性表位和空間表位從而降低致敏蛋白的致敏性。近年來(lái)科學(xué)研究者一直在尋找更適合加工處理的酶，Oliveira 等[26]發(fā)現(xiàn)黑脈金斑蝶（D.Plexippus）中的腸道肽酶能夠進(jìn)行牛奶中蛋白質(zhì)水解。經(jīng)肽酶水解后，再經(jīng)熱處理，β-乳球蛋白的水解性得到進(jìn)一步顯著提升，降低了潛在的致敏性。此外，研究中還評(píng)估了4 種不同肽酶，發(fā)現(xiàn)來(lái)自橡膠紫茉莉的乳膠肽酶（cryptostegia grandiflora latex proteins，CgLP）和番木瓜的乳膠肽酶（carica papaya latex proteins，CapLP）在降低抗原性和變應(yīng)原性方面表現(xiàn)出最佳性能，可作為水解牛奶中蛋白質(zhì)用肽酶的新來(lái)源，具有廣泛的應(yīng)用前景[27]。

研究表明，酶的種類、酶解方式和條件都與致敏蛋白的水解程度有關(guān)。各個(gè)酶的作用位點(diǎn)均有差異，具體見表1，因此多種酶的共同應(yīng)用可顯著克服單一酶水解位點(diǎn)的局限性，更好的降低乳品蛋白致敏性。付莉等[28]研究發(fā)現(xiàn)用風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)牛乳蛋白進(jìn)行水解，其蛋白致敏性明顯降低。酶法水解和其他加工處理技術(shù)結(jié)合使用同樣可以有效降低乳品致敏性，Azdad 等[29]以1000 名對(duì)牛奶敏感的摩洛哥人為研究對(duì)象，將牛奶中酪蛋白進(jìn)行熱處理和胃蛋白酶水解，結(jié)果顯示，僅3.6%的人報(bào)告對(duì)牛奶過敏，表明通過熱處理和胃蛋白酶水解足以消除該研究群體中酪蛋白引起過敏反應(yīng)的大多數(shù)表位，其原因可能是加熱變性消除了構(gòu)象表位，同時(shí)胃蛋白酶作用在順序表位上變得更有效。當(dāng)然，酶水解只能在一定程度上降低乳品蛋白的致敏性，但不能完全消除。在處理過程中，酶類型和反應(yīng)條件的差異可能導(dǎo)致乳品的風(fēng)味差異。

2.4 乳酸發(fā)酵

乳酸發(fā)酵也可以在一定程度上降低乳品蛋白致敏性。研究表明可能的主要機(jī)制有兩種，一是乳酸菌在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生一些肽酶、蛋白酶等具有水解作用的酶，這些酶會(huì)水解乳品中的過敏原蛋白，進(jìn)而降低蛋白致敏性；二是乳酸菌能降低炎癥性細(xì)胞因子的分泌，可有效調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，從而減少過敏[31]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵菌種和發(fā)酵條件對(duì)牛乳蛋白的抗原性有重要影響，目前國(guó)內(nèi)外可降低牛乳致敏性的發(fā)酵菌種見表2。

表2 可降低牛乳蛋白致敏性的發(fā)酵菌種Table 2 Fermentation strain that can reduce the allergenicity of milk protein

2.5 其他方法

此外，研究發(fā)現(xiàn)高壓、微波、輻照、超聲波等加工方式可改善乳品致敏性。高壓處理通過影響致敏蛋白分子中的疏水鍵和非共價(jià)鍵，從而改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，起到降低蛋白致敏性的作用。Daniel 等[32]發(fā)現(xiàn)高壓預(yù)處理增強(qiáng)了胃蛋白酶水解乳清蛋白的能力，更好地降低了乳清蛋白的致敏性。高靜水壓力和高壓微射流技術(shù)是目前的研究熱點(diǎn)，王偉等[33]介紹了目前高靜壓技術(shù)在降低食物致敏性方面的研究進(jìn)展。Chen 等[34]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過動(dòng)態(tài)高壓微流化（dynamic high-pressure microfluidization，DHPM）處理后，半乳糖糖化的β-乳球蛋白與IgE 結(jié)合能力得到了有效的降低。高強(qiáng)度超聲波處理也可以更有效降低致敏性，Liu 等[35]探究了超聲波預(yù)處理對(duì)β-乳球蛋白糖化和變應(yīng)原性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其致敏性顯著降低。Ma 等[36]研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理增加了β-乳球蛋白被胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的程度。以上加工技術(shù)對(duì)乳品的成分改變較少，減少了營(yíng)養(yǎng)流失，與酶解、發(fā)酵等方法相結(jié)合，同樣可以更大程度地降低乳品蛋白的致敏性。

3 展望

乳品過敏原檢測(cè)對(duì)評(píng)價(jià)乳品的安全性至關(guān)重要。雖然隨著研究的深入，各個(gè)檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性和靈敏度都有了很大的提高，也不斷有新的技術(shù)被發(fā)掘，但如何準(zhǔn)確地檢測(cè)評(píng)估乳品加工過程中的致敏蛋白以及如何排除其他蛋白對(duì)檢測(cè)的干擾仍是本領(lǐng)域面臨的難題。借助于新的技術(shù)手段和理論創(chuàng)新，乳品中致敏蛋白的檢測(cè)將更加快捷和準(zhǔn)確，以確保乳品安全。目前部分加工處理技術(shù)已經(jīng)可以有效降低乳品中致敏蛋白的致敏性，但對(duì)處理過程中發(fā)生的復(fù)雜的物理化學(xué)變化以及影響機(jī)制尚不明確，此外，在處理過程中乳品風(fēng)味改變、致敏性增強(qiáng)，甚至產(chǎn)生有安全隱患的副產(chǎn)物等情況依然存在，實(shí)際上這些已經(jīng)成為影響乳品行業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。因此在后續(xù)研究過程中，需要進(jìn)一步探究致敏蛋白關(guān)聯(lián)的乳品加工全過程中產(chǎn)生的理化變化，保障乳品的食用品質(zhì)。