（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

牦牛發(fā)酵乳風(fēng)味獨(dú)特，口感細(xì)膩，富含維生素C、B族維生素、游離鈣、氨基酸等生物活性物質(zhì)，具有良好的醫(yī)療保健功能和美容功效[1]。牦牛乳在發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌產(chǎn)生的蛋白酶(復(fù)合)降解蛋白質(zhì)，可達(dá)到較高的水解度，其分解的蛋白質(zhì)多肽有酪新素[2]、酪激肽[3]、降血壓肽[4]、乳鐵蛋白肽[5]、凝血素抑制肽[6]等及一些還沒(méi)被具體鑒定的功能肽。

自由基具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞[7,8]，引起衰老和慢性疾病，如心血管疾病、癌癥和糖尿病等[9,10]?？寡趸膶?duì)自由基有良好的清除作用，可緩解自由基對(duì)機(jī)體造成的損傷。近年來(lái)，抗氧化肽的開(kāi)發(fā)成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，如從動(dòng)物蛋白源中酶解或提取乳源抗氧化肽[11,12]、火腿抗氧化肽[13]等。

天然生物活性肽通常采用直接分離提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、蛋白質(zhì)酶解法等方法來(lái)來(lái)制備。目前，通過(guò)發(fā)酵釋放肽的天然方式制備蛋白肽備受關(guān)注。段楠等[14]用干酪乳桿菌發(fā)酵豆乳制備抗氧化肽和ACE抑制肽；Chang等[15]使用長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵牛酪蛋白制備抗氧化活性肽；楊麗娜等[16]使用植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌復(fù)合菌株發(fā)酵羊乳制備抗氧化肽。目前，多肽分離純化的方法主要有: 超濾法[17]、凝膠色譜層析[18]、離子交換層析、吸附層析及高效液相色譜[19]等。但目前對(duì)牦牛發(fā)酵乳中蛋白肽的研究較少，本研究通過(guò)篩選蛋白降解能力較好的乳酸菌發(fā)酵牦牛乳制備抗氧化肽，通過(guò)超濾分離制備分子量5ku以下的蛋白肽樣品，進(jìn)一步優(yōu)化Sephadex-25層析柱分離條件，制備具有較高抗氧化活性的發(fā)酵牦牛乳蛋白肽組分，并測(cè)定其體外抗氧化活性，以期為進(jìn)一步研究牦牛乳抗氧化肽奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為功能性乳制品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

牦牛乳：采自香格里拉高山牧場(chǎng)；Sephadex-25葡聚糖凝膠，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 菌株

CICC 6063嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、CICC 20264植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、CICC 20241副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、CICC 20262干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、CCTCC M 204058約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)，均保藏于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，使用前活化。

1.1.3 試劑

10% TCA、茚三酮顯色液、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS），上海晶純生化科技股份有限公司；谷胱甘肽（GSH）標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%），上海源葉生物科技有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

URA14M0018分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司；TGL20M高速冷凍離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；SVJ-358智能商用型酸奶機(jī)，北京世紀(jì)陽(yáng)光科技發(fā)展有限公司；UL40BC乳成分分析儀，杭州浙大優(yōu)創(chuàng)科技有限公司；SW-CJ-IF單人雙面超凈無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州江東精密儀器有限公司；HPX-9272ME恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；GMSX-280壓力蒸汽滅菌器，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵牦牛乳菌株的篩選

以水解度和肽得率為指標(biāo)，從6株乳酸菌中篩選出發(fā)酵牦牛乳高產(chǎn)蛋白肽和高水解度的菌株，結(jié)合保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵牦牛乳制備蛋白肽。

1.2.1.1 發(fā)酵牦牛乳的研制

原料乳→預(yù)熱（60～65℃）→均質(zhì)（8～10MPa）→滅菌(85℃,15min)→冷卻（30～45℃）→接種→發(fā)酵（30℃，30h）→冷藏后熟（2～4℃,12h）→成品。

1.2.1.2 水解度測(cè)定

稀釋到適當(dāng)濃度的發(fā)酵牦牛乳水解液，加入1mL茚三酮顯色液，置于沸水浴中加熱15min，然后冷卻，再加入5mL 40%的乙醇溶液混勻，放置15min后，用1cm的比色皿以蒸餾水代替樣品作空白調(diào)零，在570nm處測(cè)定吸光度[20]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：y=0.0335x+0.0469（3～21μg/mL，R2=0.998；y為吸光度，x為甘氨酸濃度）。

水解度的計(jì)算公式：DH=h/htot×100%

(htot是指每克純蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)，為常數(shù)8.3mmol/g，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可知h值)。

1.2.1.3 多肽含量測(cè)定

參考徐娟等[21]的方法進(jìn)行測(cè)定。取2.5mL牦牛發(fā)酵乳離心提取液，加入2.5mL配制好的10%（w/v）三氯乙酸溶液，均勻混合，試管中樣品靜置20min，然后離心10min（3500r/min）。取上述溶液2.0mL于試管中，加入配制好的雙縮脲試劑3.0mL（樣液∶雙縮脲試劑=2:3，v/v），均勻混合，在60℃水浴條件下顯色5min，然后離心10min（2000r/min）。取上清液，在310nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算多肽含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=4.408x-0.1324（R2=0.9993；y為吸光度，x為谷胱甘肽濃度）。

1.2.2 發(fā)酵牦牛乳蛋白肽的制備

取按1.2.1.1制備且經(jīng)冷藏后熟的發(fā)酵牦牛乳于4℃4000×g離心20min，取上清液，用5ku超濾膜低溫過(guò)濾，收集分子量＜5ku的發(fā)酵牦牛乳蛋白肽，冷凍干燥制得凍干粉，備用。

1.2.3 發(fā)酵牦牛乳蛋白肽的分離純化

采用SephadexG-25葡聚糖凝膠進(jìn)行蛋白肽的分離，將處理好的葡聚糖凝膠裝柱平衡后加入一定濃度的牦牛乳蛋白肽溶液，連接好SBS-100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器，收集分離液，測(cè)定220nm下的吸光值，繪制分離色譜圖。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化Sephadex-25色譜柱分離的洗脫液（NaCl）濃度、流速、上樣濃度。

1.2.3.1 NaCl洗脫液濃度的篩選

分別使用0.1、0.15和0.2mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，繪制特征吸收峰的出峰圖，根據(jù)洗脫峰型確定最佳洗脫液濃度。

1.2.3.2 洗脫流速的篩選

分別在0.5、1.0和2.0mL/min洗脫流速下進(jìn)行洗脫，繪制特征吸收峰的出峰圖，根據(jù)洗脫峰型確定最佳洗脫流速。

1.2.3.3 上樣濃度的篩選

分別對(duì)Sephadex-25 柱加載質(zhì)量濃度為30、40和50mg/mL的發(fā)酵牦牛乳蛋白肽樣液，繪制特征吸收峰的出峰圖，根據(jù)洗脫峰型確定最佳上樣濃度。

1.2.4 體外抗氧化活性測(cè)定

參考楊瑞文[22]的方法進(jìn)行 ABTS自由基清除率測(cè)定；參考Lin等[23]的方法進(jìn)行 DPPH自由基清除率測(cè)定；參考Oyaizu[24]的方法并加以改良，進(jìn)行還原能力測(cè)定；參考朱曉宦等[25]的方法進(jìn)行羥自由基清除率測(cè)定。

1.2.5 體外抗氧化活性IC50值的測(cè)定

將發(fā)酵牦牛乳蛋白肽各分離組分配制成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的不同質(zhì)量濃度試驗(yàn)點(diǎn)（≥5），分別測(cè)定其ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力、羥自由基清除率。以發(fā)酵牦牛乳蛋白各分離組分肽濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)定值為縱坐標(biāo)，繪制擬合曲線(xiàn)，從曲線(xiàn)中計(jì)算出IC50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 2017和Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS 24對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵牦牛乳高產(chǎn)多肽菌株的篩選

發(fā)酵法通過(guò)微生物發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的蛋白酶降解蛋白質(zhì)，可達(dá)到較高的水解度，從而降低酶法生產(chǎn)低聚肽的成本。該方法已成為近年來(lái)研究肽制備工藝的熱點(diǎn)。各菌株組合發(fā)酵牦牛乳的水解度和肽得率如圖1所示。

圖1 發(fā)酵牦牛乳高產(chǎn)多肽菌株篩選

由圖1可以看出，6株乳酸菌在相同條件下發(fā)酵牦牛乳的肽得率和水解度各不同，且水解度與肽得率具有一定的相關(guān)性。羅伊氏乳桿菌和約氏乳桿菌具有較強(qiáng)的蛋白水解能力和產(chǎn)多肽能力，原因可能是這兩株菌能產(chǎn)生胞外蛋白酶將大分子酪蛋白水解成多肽。這兩株菌結(jié)合保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵的牦牛乳水解度和肽得率為分別19.10%、15.37%和481.2μg/mL、442.56μg/mL。馬嵐等[26]通過(guò)副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌及嗜熱鏈球菌發(fā)酵羊乳制備出還原能力、總抗氧化能力、DPPH自由基清除率較強(qiáng)的羊乳蛋白肽，與本研究存在差異，可能是因?yàn)樵先椴煌约叭樗峋Y選條件的不同。

2.2 發(fā)酵牦牛乳蛋白肽的分離純化

2.2.1 上樣濃度對(duì)Sephadex-25層析分離發(fā)酵牦牛乳蛋白肽的影響

上樣濃度對(duì)Sephadex-25層析分離效果的影響較大，濃度過(guò)高會(huì)增大溶液的黏度，使分子運(yùn)動(dòng)受到限制，但上樣濃度過(guò)小，分離后各組分含量較少，實(shí)驗(yàn)效率低。當(dāng)洗脫液為0.1mol/LNaCl、流速為1mL/min，上樣質(zhì)量濃度分別為30、40、50mg/mL時(shí)，Sephadex-25層析分離發(fā)酵牦牛乳蛋白肽色譜圖如圖2所示。

從圖2中可看出，當(dāng)濃度為30、40mg/mL時(shí)，第一個(gè)特征吸收峰較好，但第二個(gè)特征吸收峰的洗脫率較低，造成洗脫液的浪費(fèi)。當(dāng)質(zhì)量濃度為50mg/mL時(shí)，兩個(gè)峰峰型對(duì)稱(chēng)，出峰面積大，分離效果都較好。綜合考慮，選擇最佳上樣質(zhì)量濃度為50mg/mL。三個(gè)上樣濃度下色譜峰都出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，原因是洗脫液流速太低，后續(xù)應(yīng)進(jìn)行洗脫流速的優(yōu)化。

圖2 不同樣品質(zhì)量濃度Sephadex-25分離色譜圖

2.2.2 NaCl洗脫液流速對(duì)Sephadex-25層析分離發(fā)酵牦牛乳蛋白肽的影響

圖3 不同洗脫液流速Sephadex-25分離色圖譜

流速對(duì)葡聚糖凝膠色譜的分離純化有一定的影響，流速過(guò)快，易導(dǎo)致柱壓升高、峰拖尾等現(xiàn)象，分離效果不好，而流速過(guò)慢會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)散加劇，從而影響分離效果，而且過(guò)慢的流速會(huì)出現(xiàn)樣品擴(kuò)散、譜峰變寬，延長(zhǎng)分離時(shí)間，降低各分離組分的濃度。當(dāng)NaCl濃度為0.15mol/L、上樣濃度為50mg/mL，洗脫流速分別為1、2、2.5mL/min時(shí)，Sephadex-25層析分離發(fā)酵牦牛乳蛋白肽色譜圖如圖3所示。

從圖3可看出，隨著洗脫流速的增加，特征吸收峰的出峰時(shí)間提前。在流速為1mL/min時(shí)，第一個(gè)和第二個(gè)特征吸收峰明顯降低，峰形較寬，這可能是由于較低流速引起樣品擴(kuò)散，引起峰拖尾等副作用所造成的；在流速為2.5mL/min時(shí)，第一個(gè)和第二個(gè)特征吸收峰洗脫脫率升高，出峰時(shí)間早，但峰2出現(xiàn)前沿，和峰1的分離度相對(duì)較低。在2.0mL/min流速下，分離出來(lái)的兩個(gè)特征吸收峰峰型和分離狀態(tài)良好，出峰面積大，提高了洗脫效率，因此選擇最佳洗脫流速為2.0mL/min。

2.2.3 NaCl洗脫液濃度對(duì)Sephadex-25層析分離發(fā)酵牦牛乳蛋白肽的影響

當(dāng)洗脫液流速為2mL/min、上樣質(zhì)量濃度50mg/mL，NaCl洗脫液濃度分別為0.1、0.15、0.20mol/L時(shí)，Sephadex-25層析分離發(fā)酵牦牛乳蛋白肽色譜圖如圖4所示。

圖4 不同洗脫液濃度Sephadex-25分離色圖譜

從圖4中可看出，NaCl洗脫液濃度為0.10mol/L時(shí)，出峰面積相對(duì)較小，可能的原因是NaCl濃度過(guò)低未能把多肽洗脫下來(lái)。當(dāng)用濃度為0.15、0.2mol/L的NaCl洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，出峰面積較大，峰型也相對(duì)較好，但濃度為0.2mol/L時(shí)的峰面積最大，因此選用濃度為0.20mol/L的NaCl溶液為最佳洗脫濃度。

2.2.4 發(fā)酵牦牛乳蛋白肽分離純化最佳工藝條件

在最佳的上樣濃度、洗脫液濃度和洗脫液流速下，經(jīng)多次分離得到的最佳發(fā)酵牦牛乳蛋白肽的Sephadex-25分離色譜圖如圖5所示。

圖5 發(fā)酵牦牛乳蛋白肽最佳分離色圖譜

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定Sephadex-25層析色譜分離最佳洗脫工藝為：洗脫液濃度0.2mol/L，上樣質(zhì)量濃度50mg/mL，洗脫流速2mL/min。在此條件下的峰分離度較好，峰型對(duì)稱(chēng)（圖5）。在最佳分離條件下大量收集峰1和峰2組分，透析48h后，濃縮冷凍干燥，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 發(fā)酵牦牛乳蛋白肽體外抗氧化活性

2.3.1 ABTS自由基清除能力

發(fā)酵牦牛乳蛋白肽各組分在不同質(zhì)量濃度下的ABTS自由基清除率如圖6所示。

圖6 各組分ABTS自由基清除率

表1 各組分ABTS自由基清除率的IC50

由圖6可知，隨著發(fā)酵牦牛乳蛋白肽各組分濃度的提高，ABTS自由基清除活性顯著增強(qiáng)，分離組分峰1的ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為2mg/mL時(shí)，ABTS自由基的清除率為53.37%，而峰2和分子量＜5ku的牦牛酸奶蛋白肽組分的ABTS自由基清除率相對(duì)較弱，分別為26.38%、38.15%。三個(gè)組分的ABTS自由基清除能力IC50如表1所示，其中，峰2的IC50最高，為3.844mg/mL，分子量＜5ku的IC50居中，為2.554mg/mL，差異顯著（P＜0.05），峰1的IC50最低，為1.778mg/mL。

2.3.2 DPPH自由基清除能力

發(fā)酵牦牛乳蛋白肽各組分在不同質(zhì)量濃度下DPPH自由基清除率如圖7所示。

圖7 各組分DPPH自由基清除率

表2 各組分DPPH自由基清除率的IC50

由圖7可知，發(fā)酵牦牛乳分離得到的各組分均具有清除DPPH自由基的能力，且DPPH自由基清除活性與蛋白肽濃度呈正相關(guān)關(guān)系。在質(zhì)量濃度為2mg/mL時(shí)，發(fā)酵牦牛乳蛋白肽組分峰1、峰2和分子量＜5ku發(fā)酵牦牛乳蛋白肽對(duì)DPPH自由基的清除率分別為：53.02%、29.90%和43.32%，其中峰1的DPPH自由基清除率最強(qiáng)。三個(gè)組分的DPPH自由基清除能力IC50如表2所示。其中，峰2的IC50最高，為3.286mg/dL，分子量＜5ku的IC50居中，為2.296mg/mL，峰1的IC50最低為1.801mg/mL（P＜0.05）。

2.3.3 還原能力

發(fā)酵牦牛乳蛋白肽各組分在不同質(zhì)量濃度下的還原能力如圖8所示。

圖8 各組分還原能力

表3 各組分還原能力的IC50

由圖8可知，發(fā)酵牦牛乳蛋白肽各組分都有一定的還原能力，還原能力與其濃度成量效關(guān)系。其中峰1的還原能力最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為2mg/mL時(shí)，其還原能力為1.093，峰2和分子量＜5ku發(fā)酵牦牛乳蛋白肽的還原能力較弱，分別為0.668和0.888。三個(gè)組分的還原能力IC50如表3所示。其中，峰2的IC50最高，為1.365mg/mL，分子量＜5ku的IC50居中，為0.869mg/mL，峰1的IC50最低，為0.571mg/mL（P＜0.05）。

2.3.4 羥自由基清除能力

發(fā)酵牦牛乳蛋白肽各組分在不同質(zhì)量濃度下的羥自由基清除能力如圖9所示。

圖9 各組分羥自由基清除率

表4 各組分羥自由基清除能力的IC50

根據(jù)圖9可以看出，發(fā)酵牦牛乳蛋白肽各組分羥自由基清除率與其濃度呈明顯的正相關(guān)。其中峰1的自由基清除能力最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為2mg/mL時(shí)，峰1、峰2和分子量＜5ku發(fā)酵牦牛乳蛋白肽對(duì)羥自由基的清除率分別為：79.15%、38.06%和52.86%。三個(gè)組分的羥自由基清除能力IC50如表4所示。其中，峰2的IC50最高，為2.466mg/mL，分子量＜5ku的IC50居中，為1.818mg/L，峰1的IC50最低，為0.913mg/mL（P＜0.05）。

杜昕等[27]通過(guò)超濾得到分子量小于5ku的牦牛血抗氧化肽具有最高的抗氧化活性，且經(jīng)過(guò)Sephadex G-25層析后得到4個(gè)組分，其中組分Ⅰ抗氧化活性最高。高維東等[28]通過(guò)超濾、Sephadex G-15和高效液相色譜分析表明，牦牛酪蛋白抗氧化肽主要集中在200～2 500u之間。本試驗(yàn)通過(guò)超濾得到分子量小于5ku的發(fā)酵牦牛乳抗氧化肽，再經(jīng)過(guò) Sephadex G-25層析分離后得到2個(gè)組分，其中峰1的抗氧化活性最高，說(shuō)明抗氧化肽活性與其分子量有一定關(guān)系，但并非分子量越小，抗氧化活性越高，抗氧化活性還應(yīng)與原料蛋白特點(diǎn)及酶切位點(diǎn)等有關(guān)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)從6株乳酸菌中篩選出對(duì)發(fā)酵牦牛乳具有較高水解度及肽得率的羅伊氏乳桿菌和羅伊斯乳桿菌，并與保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和發(fā)酵乳桿菌按1:1:1:1:1復(fù)配發(fā)酵劑制備牦牛乳蛋白肽。發(fā)酵牦牛乳蛋白肽Sephadex-25層析色譜分離的最佳條件為：洗脫液濃度0.2mol/L，上樣質(zhì)量濃度50mg/mL，洗脫流速2mL/min，一共分離出峰1、峰2兩個(gè)組分。隨著蛋白肽各分離組分質(zhì)量濃度的增加，其抗氧化活性顯著增強(qiáng)，組分峰1、峰2對(duì)ABTS自由基清除率的IC50為1.778mg/mL、3.844mg/mL，對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為1.801mg/mL、3.286mg/mL，還原能力IC50為0.571mg/mL、1.365mg/mL，對(duì)羥自由基清除率的IC50為0.913mg/mL、2.466mg/mL。