金宗安,劉澤君,唐雅麗 ,關(guān)保華2,劉正文,2,任麗娟

(1：暨南大學(xué)生態(tài)系與水生生物研究中心,廣州 510632) (2：中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊科學(xué)與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210008)

沉積物是河流的重要組成部分，是各種人為污染物如重金屬、營養(yǎng)物和有機(jī)物等[1]的匯. 沉積物中污染物的降解消耗大量溶解氧導(dǎo)致厭氧微生物大量繁殖，厭氧微生物分解有機(jī)物，產(chǎn)生大量的惡臭氣體，并形成一些黑色物質(zhì)，最終導(dǎo)致生物多樣性銳減和生態(tài)功能的退化[2].

淡水沉積物中的細(xì)菌群落是有機(jī)物和營養(yǎng)物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)、污染物的生物降解和轉(zhuǎn)化以及生態(tài)系統(tǒng)健康維持的關(guān)鍵參與者之一[3-4]. 水生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)鹽、環(huán)境和污染狀況的任何變化都將直接影響細(xì)菌群落，進(jìn)而影響營養(yǎng)鹽循環(huán)和其他生物群落，因此，細(xì)菌群落可作為環(huán)境狀況的評價(jià)指標(biāo)[5]. 研究沉積物中細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與其生境的變化關(guān)系，對于開展黑臭河道的生態(tài)治理具有重要意義.

添加硝酸鈣是沉積物處理的有效手段，硝酸鹽作為電子受體可被大量與有機(jī)物氧化相關(guān)的微生物還原，進(jìn)而促進(jìn)有機(jī)污染物的生物降解[6]. 與硝酸鹽相比，添加生物促生劑可為微生物提供多種營養(yǎng)物質(zhì)，有效促進(jìn)土著微生物的增殖和活性，同時(shí)抑制有害微生物的代謝和污染物的厭氧分解，進(jìn)而刺激和加速自然生化反應(yīng)[7]. 種植沉水植物作為控制內(nèi)源負(fù)荷的有效手段，可提升沉積物的氧化還原電位及其對磷的滯留能力[8]，減少沉積物中磷、銨和硝酸鹽向上覆水釋放[9]. 然而，這些研究通常側(cè)重于沉積物及水體理化性質(zhì)的變化，關(guān)于沉積物中的污染物與細(xì)菌群落之間的相互作用及其在水生態(tài)系統(tǒng)功能和服務(wù)中的作用研究相對較少[10]，細(xì)菌群落對污染物的響應(yīng)和恢復(fù)力方面的研究也較為缺乏[11].

本文應(yīng)用人工模擬系統(tǒng)，旨在探究黑臭河道沉積物經(jīng)添加硝酸鈣、生物促生劑以及種植沉水植物處理后，沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，明確不同細(xì)菌群落在黑臭河道處理中的作用，確定導(dǎo)致底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異的主要物種，為城市黑臭河道細(xì)菌群落的改善和綜合治理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

采集蘇州市東山鎮(zhèn)上的黑臭河道表層(0～20 cm)富含有機(jī)質(zhì)且呈黑臭狀態(tài)的底泥，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn); 實(shí)驗(yàn)用水來源于南京地理湖泊研究所東太湖實(shí)驗(yàn)站附近的池塘，呈黑臭狀態(tài). 生物促生劑由河南華宇環(huán)?？萍加邢薰咎峁缓瑺I養(yǎng)物(氮、碳、磷等)、酶、有機(jī)酸、細(xì)胞分裂素、維生素和微量元素等物質(zhì).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為空白對照組(CK組)和3個(gè)處理組，即沉水植物組(MC組)、硝酸鈣組(CN組)、生物促生劑組(BE組)，每組設(shè)置3個(gè)平行組. 實(shí)驗(yàn)裝置為30 cm×100 cm(管內(nèi)徑×高度)的柱狀PVC管，第0天時(shí)，混合所有底泥初始樣并將其定義為原泥(CS組). 將采集的泥樣做均一化處理后，鋪設(shè)30 cm厚度的原泥于實(shí)驗(yàn)裝置中，注入60 cm上覆水. 靜置2 d后，種植1株苦草(Vallisnerianatans) (株高: 24.0±0.5 cm，鮮重: 2.12±0.10 g/株)于MC組，一周后開始實(shí)驗(yàn). 在CN組沉積物表層往上15 cm處一次性注射45.3 g N/m2的硝酸鈣; 在相同位置將2.5 mL/(m3·d) 的生物促生劑分散注射于BE組; CK組不做任何處理. 實(shí)驗(yàn)裝置置于池塘中不密封，定期補(bǔ)充黑臭水以保持總體積. 實(shí)驗(yàn)于2016年8-9月間進(jìn)行，鑒于生物促生劑、硝酸鈣投加以及沉水植物種植對河流和沉積物的處理的現(xiàn)有相關(guān)研究持續(xù)時(shí)間為10～32 d[7,12-15]，本實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)周期為28 d，并于第0天和28天分別采集水樣和表層5 cm厚的沉積物樣品用于理化性質(zhì)和細(xì)菌指標(biāo)測試.

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(第0天)，各實(shí)驗(yàn)組主要水質(zhì)指標(biāo)為: pH: 8.60±0.11，氧化還原電位(ORP): 184±11.75 mV,溶解氧(DO): 6.49±0.93 mg/L,總氮(TN): 2.25±0.33 mg/L,總磷(TP): 0.21±0.07 mg/L；底泥中各指標(biāo)為：pH: 6.92±0.03，ORP: 18.24±4.08 mV，TN: 3.97±0.60 mg/g，TP: 3.00±0.83 mg/g，總有機(jī)碳(TOC): 36.46±6.43 mg/g.

1.3 樣品相關(guān)測定方法

1.3.1 沉積物理化指標(biāo)測定 沉積物樣品pH、ORP采用FJA-6型氧化還原電位去極化全自動測定儀測定; TN、TP含量采用元素分析儀(EA3000，Italy，Euro Vector)測定，TOC含量通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(American，Leeman，prodigy)測定.

1.3.2 細(xì)菌多樣性指數(shù)測定 沉積物樣品經(jīng)預(yù)處理后，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(簡稱美吉)的Illumina Miseq平臺測序，利用引物338F/806R擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物.

1.4 生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析使用美吉公司提供的I-Sanger平臺進(jìn)行. 采用Mothur軟件對97%相似水平的OTU進(jìn)行Alpha多樣性分析. 采用R語言的vegan包進(jìn)行樣本的熱圖分析(Heapmap)、非度量多維尺度(NMDS)分析和冗余分析(RDA). 采用R語言的stats包和Python的scipy包進(jìn)行One-way ANOVA分析.

2 結(jié)果

2.1 水體及沉積物理化性質(zhì)分析

經(jīng)過28 d處理后，CN組上覆水中TN含量顯著高于CK組(P<0.05，表1)，各處理組DO、ORP均高于CK組，其中，BE組DO含量顯著高于CK組(P<0.05). 沉積物中3組處理組ORP均顯著高于CK組(P<0.05); MC組和CN組TN含量顯著低于CK組和BE組(P<0.05); MC組TP含量比CK組降低了5.80%，而CN組和BE組TP含量較CK組分別升高了1.90%和4.61%; TOC含量從大到小依次為BE組>CK組>CN組>MC組. 此外，與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)相比，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)苦草株高(35.83±2.36 cm)、鮮重(4.10±1.13 g/株)和株數(shù)(2.67±0.58 株)均顯著增加(P<0.05).

*數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，不同字母標(biāo)記的數(shù)值表示在5%的顯著性水平下有顯著性差異.

2.2 不同生態(tài)處理方法對細(xì)菌多樣性的影響

利用Illumina MiSeq測序技術(shù)研究不同實(shí)驗(yàn)組底泥細(xì)菌的多樣性. 共檢測到559332條高質(zhì)量序列，平均長度為440 bp，覆蓋度介于95.96%～96.34%之間; 不同實(shí)驗(yàn)組底泥共鑒定出OTU數(shù)量6057個(gè)，結(jié)果涵蓋54門，128綱，259目，445科，781屬. 在OTU分析的基礎(chǔ)上，通過計(jì)算Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、PD (Phylogenetic diversity)指數(shù)、Sobs指數(shù)、Chao 1和ACE豐富度對各實(shí)驗(yàn)組樣本的多樣性和豐富性進(jìn)行評價(jià)(表2). 結(jié)果顯示: BE組Sobs指數(shù)和Chao 1指數(shù)均顯著高于CK組和CN組(P<0.05); 且BE組Shannon指數(shù)和PD指數(shù)顯著高于CN組(P<0.05).

表2 不同實(shí)驗(yàn)組表層沉積物細(xì)菌多樣性指數(shù)*

*數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，不同字母標(biāo)記的數(shù)值表示在5%的顯著性水平下有顯著性差異.

2.3 不同生態(tài)處理方法對細(xì)菌群落組成的影響

圖1 門分類水平上的細(xì)菌群落組成Fig.1 Community composition of bacteria in the phylum level

5組底泥樣品中細(xì)菌主要包括:Proteobacteria(39.53%～41.68%)、Chloroflexi(17.72%～24.19%)、Firmicutes(2.1%～12.5%)、Bacteroidetes(4.65%～7.91%)和Spirochaetae(2.55%～3.39%)，除上述5種優(yōu)勢菌門外，OTU平均相對豐度大于1% 的還有Acidobacteria、Latescibacteria、Aminicenantes、Nitrospirae、Chlorobi、Actinobacteria、Parcubacteria、TA06、Candidate_division_OP3. 有1.54%～2.55% 的序列不能在門一級進(jìn)行分類，定義為bacteria-unclassified，將樣本中豐度均值占比均小于1% 的物種歸為others(圖1).Proteobacteria和Chloroflexi是各實(shí)驗(yàn)組中最豐富的門，在各組中無顯著差異(P>0.05);在Proteobacteria中，Deltaproteobacteria(14.19%～22.91%)、Betaproteobacteria(7.68%～16.19%)和Gammaproteobacteria(7.72%～13.25%) 是所有實(shí)驗(yàn)組中最豐富的綱. BE組中Firmicutes顯著低于其他組(P<0.05); 相反，BE組Bacteroidetes和Spirochaetae的相對豐度均顯著高于其余各組(P<0.05).

Heatmap圖顯示了底泥細(xì)菌群落前30屬的物種組成(圖2). 對各實(shí)驗(yàn)組最豐富的5屬進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)分析(one-way ANOVA)，結(jié)果表明: uncultured_Anaerolineaceae(P<0.01)、Ferribacterium(P<0.01) 和uncultured_Xanthomonadales_Incertae_Sedis (P<0.05)是導(dǎo)致底泥細(xì)菌群落變化的主要菌屬.

基于Bray-Curtis距離對不同實(shí)驗(yàn)組底泥細(xì)菌群落組成的OTU分布統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非度量多維尺度分析(NMDS)和ANOSIM分析，結(jié)果顯示: 不同生態(tài)處理方法顯著改變了底泥群落組成(ANOSIM,r=0.4074，P=0.001); CK組和MC組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成較為類似; 而CN組和BE組與上述2組底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成具有明顯差異(圖3).

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組中細(xì)菌群落前30屬的熱圖分析(右側(cè)顏色梯度(數(shù)值)表示各組屬水平的平均相對豐度)Fig.2 Heatmap of the top 30 abundant genera in bacterial communities detected from different groups (the color of the spots in the right panel represents the mean relative abundance of the genera in each group)

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

為進(jìn)一步探究環(huán)境變量對底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行RDA分析. 前兩個(gè)軸分別解釋了底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異的19.03%和10.69% (圖4). 環(huán)境變量包括底泥的pH、ORP、TN、TP、TOC，其中，ORP是影響底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子(P<0.01).

3 討論

3.1 不同生態(tài)處理改變了上覆水和沉積物的理化特征

沉積物原位修復(fù)技術(shù)通常用于控制沉積物中污染物的釋放. 已有研究表明，在沉積物中添加硝酸鈣可有效提升沉積物的ORP值，促進(jìn)沉積物中TOC的降解[6，13]. 同時(shí)，硝酸鹽鈣的加入能固定鐵磷和鈣磷[13-14,16]，降低水體中的TP，增加底泥TP，并減少底泥磷的釋放. 另外，在底泥中注入硝酸鈣加速了反硝化作用，提高了細(xì)菌的活性，使氮以氣體形式排出，進(jìn)而提高了脫氮效果[6,13-14,16]. 添加生物促生劑也可提升沉積物的ORP值和DO值，通過細(xì)菌活性和多樣性持續(xù)增加，促進(jìn)了其對碳的呼吸以及氮、磷的同化作用，最終降低底泥TOC含量，并使得水體中氮、磷元素固定在沉積物中[7，17]. 種植沉水植物作為控制內(nèi)源負(fù)荷的有效手段，可通過根際泌氧提升沉積物的ORP值[8]，并通過生長吸收氮、磷，進(jìn)而減少水體和沉積物中的氮、磷[8-9,18].

圖3 基于Bray-Curtis距離的NMDS分析Fig.3 NMDS analysis based on Bray-Curtis distance

圖4 細(xì)菌群落組成和環(huán)境變量的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of bacteria community compositions and environmental variables

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過28 d處理后,僅BE組上覆水中DO濃度顯著高于CK組，CN組TN濃度顯著高于CK組，其他參數(shù)改善效果不明顯，這可能是由于處理時(shí)間較短所致. 但各處理組ORP和DO的平均值均高于CK組，各處理組TP平均濃度均小于CK組; 除CN組外，MC組和BE組TN平均濃度較CK組相比，均有不同程度下降，表現(xiàn)出一定的改善趨勢.

沉積物中，所有處理組的ORP值均顯著高于對照組，且CN組和BE組的ORP值顯著高于MC組，MC組和CN組的TN含量顯著低于CK組. 這些參數(shù)表明底泥理化性質(zhì)得到一定程度的改善. CN組和BE組沉積物TP含量雖然沒有顯著上升，但其平均含量均高于對照組,這兩組水體TP平均含量的下降提示了這兩個(gè)處理組沉積物對水體磷的固定趨勢. 與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)相比，MC組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)苦草株高、鮮重和株數(shù)均顯著增加，MC組水體和底泥TN和TP平均含量均有所下降. CN組和MC組沉積物TOC平均含量也有下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[13-14,19].

3.2 不同生態(tài)處理方法改變了底泥細(xì)菌多樣性

基于16S rRNA的Miseq測序表明，處理組底泥細(xì)菌發(fā)生了很大的變化. 以大于97%相似度OTU作為分類單元計(jì)算，BE組Sobs指數(shù)和Chao 1指數(shù)均顯著高于CK組; BE組Shannon指數(shù)和PD指數(shù)顯著高于CN組. 這表明黑臭河道底泥細(xì)菌對不同生態(tài)處理方法的響應(yīng)不盡相同，生物促生劑的投加可在一定程度上提升底泥細(xì)菌多樣性，這可能是由于生物促生劑中富含多種營養(yǎng)素(如酶、氨基酸、維生素等)，可有效促進(jìn)細(xì)菌的增殖并增加其活性[7]. 研究發(fā)現(xiàn)沉積物注入硝酸鈣后，底泥細(xì)菌的多樣性隨溫度升高呈下降趨勢; 當(dāng)沉積物的溫度為25或35℃時(shí)，底泥細(xì)菌的多樣性甚至低于原底泥指標(biāo)[20]. 本實(shí)驗(yàn)期間，水溫介于23.24～30.26℃之間，在這一溫度條件下，某些物種的富集可能是導(dǎo)致CN組底泥細(xì)菌多樣性降低的主要原因.

3.3 不同生態(tài)處理方法顯著改變了底泥細(xì)菌群落組成

本研究中各實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與以往關(guān)于沉積物的研究結(jié)果基本一致[4,21-22].Proteobacteria和Chloroflexi是各實(shí)驗(yàn)組中最豐富的門，在各組中無顯著差異; 本實(shí)驗(yàn)中，BE組中Firmicutes顯著低于其他組;Firmicutes是糞便污染的重要指標(biāo)，它是識別人類糞便的標(biāo)志之一[23]. 研究表明，F(xiàn)irmicutes是異養(yǎng)反硝化菌，常見于廢水處理過程的反硝化生物反應(yīng)器中[24]，其在CN組豐度較高可能是由于添加硝酸鈣后反硝化作用增強(qiáng)，促使其轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢菌群. 生物促生劑的投加改變了底泥的還原性環(huán)境，從而抑制了反硝化細(xì)菌及厭氧氨氧化菌的活性，這是其在BE組顯著低于其他各組的主要原因[12]. Wang等[25]的研究表明城市段河流中Bacteroidetes豐度較高的原因可能與居住區(qū)未經(jīng)處理的排放廢水中含有硝酸鹽、氨、糞便等污染物有關(guān); BE組中Bacteroidetes豐度較高可能是由于生物促生劑富含多種營養(yǎng)素(如碳、氮、磷等)，可向其提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì). 目前，關(guān)于Spirochaetae菌門的生態(tài)生理功能的研究很少，Lee等[26]研究發(fā)現(xiàn)Spirochaetae可促進(jìn)碳水化合物和氨基酸發(fā)酵生成乙酸鹽、氫氣和二氧化碳; BE組中Spirochaetae的相對豐度顯著高于其余各組，這表明底泥投加生物促生劑后可有效促進(jìn)該菌門的生長和增殖.

細(xì)菌屬水平的物種組間差異顯著性檢驗(yàn)分析表明: uncultured_Anaerolineaceae、Ferribacterium和uncultured_Xanthomonadales_Incertae_Sedis是導(dǎo)致底泥細(xì)菌群落發(fā)生變化的主要菌屬. Uncultured_Anaerolineaceae是各樣本中最豐富的屬，屬于Chloroflexi門，是典型的異養(yǎng)反硝化細(xì)菌，在反硝化過程中可分解大分子有機(jī)物產(chǎn)生甲烷和二氧化碳[27]. Uncultured_Xanthomonadales_Incertae_Sedis屬于Gammaproteobacteria菌綱; 其常見于活性污泥中[28]. 另一個(gè)豐富的屬Ferribacterium屬于Betaproteobacteria菌綱，是一種鐵還原菌; 先前的研究表明，在厭氧沉積物中，F(xiàn)erribacterium可將Fe3+還原成Fe2+[29]，F(xiàn)e2+可與河道中有機(jī)物分解產(chǎn)生的 H2S 反應(yīng)生成FeS，進(jìn)而使底泥發(fā)黑. 因此，我們推測Ferribacterium豐度降低(圖2)，其代謝產(chǎn)物Fe2+的濃度也會隨之降低，進(jìn)而有利于消除河道底泥黑臭現(xiàn)象.

基于OTU的NMDS和ANOSIM分析顯示: 不同生態(tài)處理方法顯著改變了底泥群落組成，MC組和CK組的細(xì)菌群落組成較為相似，而CN組和BE組與上述2組細(xì)菌群落組成具有明顯差異. 這主要是由于底泥經(jīng)由硝酸鈣和生物促生劑處理后，CN組和BE組ORP值顯著高于CK組和MC組所致.

3.4 底泥氧化還原電位的變化是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動因素

RDA分析結(jié)果表明，ORP是影響底泥細(xì)菌群落組成的最重要因素. 有研究表明細(xì)菌的生長與ORP的變化直接相關(guān)[30]. 環(huán)境中的ORP很大程度上決定了該環(huán)境中細(xì)菌群落的代謝類型，因此它們是生物活動的重要參數(shù)[31-32]. 每種類型的微生物適應(yīng)特定的ORP條件，如厭氧土壤中微生物和酶活性與ORP呈負(fù)相關(guān)，而好氧微生物則需要更高的ORP值[33-34]. Zeng等[35]對富營養(yǎng)化湖泊沉積物中細(xì)菌群落空間分布的研究結(jié)果也表明，ORP對沉積物中細(xì)菌群落組成具有顯著影響，這也與本文的研究結(jié)果相一致.