QuEChERS/GC-MS/MS測定人參中41種農(nóng)藥殘留

姚蘊恒，白龍律，武倫鵬，吳信子，何 苗，李東浩，任秀麗

(1.延邊朝鮮族自治州檢驗檢測中心，吉林 延吉 133000；2.延邊大學 長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室,吉林 延吉 133002；3.延邊大學 工學院,吉林 延吉 133002)

人參，多年生草本植物，又稱“百草之王”，東北三寶之一，其藥用價值極高，具有抗腫瘤、抗高血壓、抗衰老、降血脂[1]等功效，作為一種膳食補充劑已被人類食用上千年。為了使人參在種植和儲存過程中免受病、蟲害侵襲，農(nóng)藥的使用必不可少[2]，因不規(guī)范使用造成人參中農(nóng)藥殘留超標時有發(fā)生，嚴重威脅消費者身體健康[3]。我國已有標準[4-5]規(guī)定了人參中農(nóng)藥殘留最大限量(MRL)，但僅涉及20多種農(nóng)藥，且以有機氯、有機磷類農(nóng)藥為主，因此，建立一種靈敏度高、高選擇性的人參中農(nóng)藥多殘留分析方法具有重要意義。

目前，我國在用農(nóng)藥有800多種，農(nóng)藥的多樣性與復雜性使其樣品前處理方法成為分析關鍵[6-7]，已有農(nóng)藥殘留檢測的樣品前處理方法主要為固相萃取法(SPE)[9]、液液萃取法(LLE)[10]、基質(zhì)固相分散萃取法(MSPD)[11]、盧克(Luke)法[12]等，但這些方法存在檢測種類單一、耗時、耗力且耗溶劑等局限?；诖?，Anastassiades等[13],于2003年發(fā)明了一種集萃取和凈化為一體的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)前處理方法，樣品經(jīng)乙腈提取分離后加入NaCl和MgSO4等鹽類除水，再加入PSA、C18等吸附劑除雜，該法又稱為Original QuEChERS方法。隨后，研究人員針對一些酸堿敏感的農(nóng)藥對該法進行了修改，其中一種采用醋酸鈉緩沖鹽提取體系的Acetate QuEChERS方法，于2007年成為美國分析化學家協(xié)會標準方法(AOAC 2007.01)；另一種采用檸檬酸緩沖鹽提取體系的Citrate QuEChERS方法，于2008年成為歐洲標準化委員會標準方法(EN 15662)。上述3種QuEChERS方法均被廣泛應用于蔬菜[14]、水果[15]、谷類[16]等食品中的農(nóng)藥多殘留檢測，但對于基質(zhì)復雜的人參樣品的檢測鮮見報道[3,8,17-19]，因此，建立一種快速分析人參中農(nóng)藥多殘留的分析方法具有重要意義。

已有研究表明，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)[20-22]比氣相色譜(GC)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)更適合農(nóng)殘檢測，這是因為GC-MS/MS采用二級MS離子定性，既可排除假陽性，又可提高檢測靈敏度和準確性?；诖?，本文依據(jù)GB/T 19506-2009《地理標志產(chǎn)品吉林長白山人參》及《中華人民共和國藥典》2015版中涉及的農(nóng)藥目錄，結合目前實際用于人參種植中的農(nóng)藥種類，選擇有機氯、有機磷、菊酯類等41種代表性農(nóng)藥作為目標分析化合物，以QuEChERS方法為基礎，建立了一種QuEChERS/GC-MS/MS檢測人參中農(nóng)藥多殘留的分析方法，并對實際樣品進行了分析檢測，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TRACE 1300氣相色譜-TSQ 8000 Evo三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，TD6M低速離心機(鹽城市凱特實驗儀器有限公司)，EVA 50A氮吹儀(北京普立泰科儀器有限公司)，QL-901渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

41種農(nóng)藥標準品溶液(100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢驗所)；內(nèi)標：磷酸三苯酯(TPP，100 μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；乙腈、乙酸乙酯、冰醋酸(色譜純，美國Fisher Chemical公司)；無水硫酸鎂(MgSO4)、無水氯化鈉(NaCl)、無水醋酸鈉(NaOAc)、N-丙基乙二胺(PSA)、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)、檸檬酸氫二鈉(Na2C6H6O7)(深圳逗點生物技術有限公司)；實驗用水為色譜純，購于德國CNW Technologies 公司。人參樣品均購于本地商場和超市。

1.2 樣品前處理

將人參樣品60 ℃干燥后，粉碎至粉末狀，均質(zhì)，備用。

1.2.1 Original QuEChERS準確稱取1 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水，搖勻后浸泡15 min，再加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，最后加入4 g 無水MgSO4和1 g NaCl，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心10 min。精密移取6 mL有機層溶液至15 mL聚丙烯離心管中，加入150 mg PSA和900 mg 無水MgSO4，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心5 min。

1.2.2 Acetate QuEChERS準確稱取1 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水，搖勻后浸泡15 min，再加入10 mL含1%(體積分數(shù))冰醋酸的乙腈，渦旋振蕩1 min，最后加入6 g 無水MgSO4和1.5 g NaOAc，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心10 min。精密移取6 mL有機層溶液至15 mL聚丙烯離心管中，加入300 mg PSA和900 mg 無水MgSO4，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心5 min。

1.2.3 Citrate QuEChERS準確稱取1 g(精確至0.000 1 g)樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水，搖勻后浸泡15 min，最后加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，最后加入4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，渦旋振蕩1 min，于3 500 r/min離心10 min。精密移取6 mL有機層溶液至15 mL聚丙烯離心管中，加入150 mg PSA和900 mg 無水MgSO4，渦旋振蕩1 min，于 3 500 r/min離心5 min。

上述3種QuEChERS程序完成后，精密移取2 mL上清液于10 mL離心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，殘渣加入20 μL內(nèi)標溶液和1 mL乙酸乙酯復溶，過0.22 μm微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至進樣小瓶，待GC-MS/MS檢測。

1.3 標準溶液的配制

內(nèi)標(TPP)溶液：取1 mL 100 μg/mL TPP標準溶液于20 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，得5 μg/mL內(nèi)標溶液，4 ℃冰箱中保存，備用。

混合標準溶液：分別取1 mL各農(nóng)藥標準溶液(100 μg/mL)于200 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋定容至刻度，得0.5 μg/mL 41種農(nóng)藥混合標準溶液，4 ℃冰箱中保存，備用。

混合標準工作溶液：準確吸取一定體積的0.5 μg/mL混合標準溶液于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯依次稀釋制得質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.1 μg/mL的混合標準工作溶液。

基質(zhì)匹配標準溶液：按照“1.2”方法前處理不含目標農(nóng)藥的“空白”人參樣品，然后精密移取2 mL上清液至10 mL離心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，加入20 μL內(nèi)標溶液，再分別加入0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.1 μg/mL的混合標準工作溶液復溶，配成對應濃度的基質(zhì)匹配標準溶液，過0.22 μm微孔濾膜，待測，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Thermo Fisher Scientific公司)。進樣口溫度280 ℃。程序升溫：初始溫度40 ℃，保持1 min；然后以40 ℃/min升至120 ℃；再以5 ℃/min升至240 ℃；最后以12 ℃/min升至300 ℃，保持6 min；總運行時間為38 min。載氣：高純氦氣(純度≥99.999%)；恒流模式，流速為1.0 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：接口溫度為280 ℃，電離模式：電子轟擊電離(EI)；轟擊能量：70 eV；離子源溫度：280 ℃;碰撞氣：高純氬氣(純度≥99.999%);溶劑延遲：5 min;選擇反應監(jiān)測(SRM)模式;Trace Finder工作站軟件用于儀器控制與數(shù)據(jù)處理。41種農(nóng)藥及內(nèi)標的保留時間、離子對信息及碰撞電壓見表1。

表1 41種農(nóng)藥和內(nèi)標化合物的化學式、保留時間、離子對及碰撞電壓Table 1 Chemical formulas,retention times,ion pairs and collision energies of the 41 pesticides and internal standard

(續(xù)表1)

*quantitative ion pair(定量離子對)

2 結果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于41種農(nóng)藥的分子極性相對較弱，因此選擇極性較小的TG-5MS石英毛細管色譜柱進行分析，并通過優(yōu)化柱箱的升溫程序，使各農(nóng)藥能夠有效分離。實驗選擇SRM模式下的兩對離子對進行分析，一對用于定量分析，一對用于定性分析，并對目標農(nóng)藥的母離子、子離子、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化,確保每個目標農(nóng)藥色譜峰的采集點數(shù)量在15個左右，以滿足響應值的要求。優(yōu)化后41種農(nóng)藥的色譜-質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖1 空白人參樣品基質(zhì)的GC-MS/MS全掃描色譜圖Fig.1 Full scan chromatograms of ginseng blank extract analysed by GC-MS/MS

2.2 前處理方法優(yōu)化

為獲得最佳的前處理方法，實驗采用“空白”人參樣品加標考察了Original、Acetate、Citrate 3種QuEChERS處理方法對人參中41種農(nóng)藥的提取效率和凈化效果。結果顯示，3種前處理方法的農(nóng)藥回收率差異顯著，Original方法有97.6%的農(nóng)藥回收率為80%～120%，Acetate方法中農(nóng)藥的回收率大多集中在40%～60%之間，而Citrate方法中僅9.5%的農(nóng)藥回收率為80%～120%。為進一步了解差異性的原因，對經(jīng)3種QuEChERS方法處理后的“空白”人參樣品進行全掃描(Full scan)，結果見圖1。由圖可見，經(jīng)Acetate方法處理的萃取液中，共萃取基質(zhì)含量最多，其次為Citrate方法，而Original方法的共萃取基質(zhì)含量最少。這是因為，Acetate和Citrate方法分別采用醋酸鈉緩沖提取體系(pH=4.8)和檸檬酸鈉緩沖提取體系(pH=5.1),兩者的提取體系均呈弱酸性，且Acetate提取體系的pH值更低，使人參中部分基質(zhì)化合物更易被共提取出來，從而增加了其共萃取基質(zhì)含量，導致目標農(nóng)藥的回收率下降。因此，本研究選擇Original QuEChERS前處理方法進行人參樣品中41種農(nóng)藥的提取和凈化。

2.3 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應(Matrix effect，ME)是指樣品中目標分析物以外的組分對目標分析物分析過程的離子化產(chǎn)生的抑制與增強作用[23-24]，基質(zhì)效應=基質(zhì)匹配工作曲線的斜率/純?nèi)軇┲泄ぷ髑€的斜率，其比值越接近1，則表明基質(zhì)效應越小，反之則表明基質(zhì)效應越大。本研究經(jīng)Original QuEChERS方法前處理后，仍有部分共萃取基質(zhì)被提取，無法完全消除基質(zhì)效應，影響分析結果的準確性，且以β-六六六(1.920)、腐霉利(1.679)、烯唑醇(1.753)、氟氰戊菊酯-1(2.322)、氟氰戊菊酯-2(2.427)的基質(zhì)效應最為明顯。因此，為降低基質(zhì)效應的影響，采用基質(zhì)匹配標準溶液進行校正。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線、檢出限及定量下限取1.0 g“空白”人參樣品，經(jīng)“1.2”方法處理后，取2 mL上清液于10 mL離心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，加入20 μL內(nèi)標溶液，再分別加入一定量標準工作溶液復溶，配成10、25、50、100、200 μg/kg的基質(zhì)匹配標準溶液，過0.22 μm微孔濾膜，在優(yōu)化條件下測定，并以各化合物的峰面積(y)為縱坐標，對應質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，制作標準曲線，結果見表2。結果顯示，41種農(nóng)藥在各自的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)均大于0.995。分別以信噪比(S/N)為3和10時計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得41種農(nóng)藥的LOD和LOQ分別為2.0～6.0 μg/kg和5.0～20.0 μg/kg，完全滿足人參中農(nóng)藥殘留的測定要求。

表2 41種農(nóng)藥的線性范圍、相關系數(shù)、加標回收率、相對標準偏差、檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges,correlation coefficients(r),recoveries,RSDs,LODs and LOQs of 41 pesticides

(續(xù)表2)

*the number and name of pesticide are identical to those in Table 1;-:no data

2.4.2 回收率與精密度取“空白”人參基質(zhì)進行41種農(nóng)藥化合物的加標(10、20、100、200 μg/kg)回收實驗，每個濃度平行實驗6次，采用基質(zhì)匹配外標法定量。結果顯示，在4個加標水平下41種農(nóng)藥的回收率為86.7%～115%，RSD均小于15%(表2)。表明本方法靈敏度高、準確性好，可用于人參中41種農(nóng)藥的同時測定。

2.5 實際樣品檢測

采用本方法在優(yōu)化條件下對本地超市和市場采集的50份人參樣品進行測定。結果顯示，2個樣品檢出甲基對硫磷，含量分別為42.9、73.1 μg/kg;1個樣品檢出氟蟲腈和毒死蜱，含量分別為36.5 μg/kg和32.9 μg/kg;1個樣品檢出腐霉利，含量為36.7 μg/kg;1個樣品中檢出除草醚，含量為30.3 μg/kg;1個樣品檢出異丙甲草胺，含量為130.0 μg/kg，1個樣品檢出甲基異柳磷，含量為22.1 μg/kg。其余樣品中41種農(nóng)藥均未檢出。圖2為一個陽性人參樣品中檢出異丙甲草胺農(nóng)藥殘留的色譜圖。

圖2 人參樣品中異丙甲草胺的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of metolachlor in ginseng sample

3 結 論

本文建立了同時檢測人參中41種農(nóng)藥殘留的QuEChERS/GC-MS/MS分析方法，并對3種QuEChERS前處理方法進行了比較。結果顯示，采用Original QuEChERS前處理方法時能夠有效去除基質(zhì)干擾，且97.6%的目標農(nóng)藥回收率在80%～120%之間，能夠滿足國內(nèi)對農(nóng)藥殘留檢測中精密度和準確度的要求。該方法操作簡單、高效、靈敏可靠，為人參中多農(nóng)藥殘留的風險評估、檢測等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。