液相色譜-串聯質譜法快速測定豬肝臟中恩拉霉素殘留量

張 艷，付 巖，吳銀良

(寧波市農業(yè)科學研究院，浙江 寧波 315040)

恩拉霉素(Enramycin)是1966年由日本武田藥品研究所發(fā)現的一株殺真菌素鏈霉菌(StreptomycesfungicidicusNo.B5477)經發(fā)酵獲得的次級代謝產物，屬于多肽類抗生素。恩拉霉素的主要成分有恩拉霉素A和恩拉霉素B，此外還有少量的恩拉霉素C和恩拉霉素D[1]。動物使用后，能改善腸道內的細菌群，可促進豬、雞增重和提高飼料轉化率，且具有低毒、低殘留特性，2005年在國內開始獲批生產使用[1]。該藥物是少數幾種可用于飼料添加的抗生素之一，但生產中為追求效益往往超量使用，一方面損傷動物的臟器組織[2]，另一方面勢必造成其在動物產品中殘留量增加。目前我國GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》和原農業(yè)部第235號公告均未規(guī)定恩拉霉素在動物可食性組織中的最大殘留量(MRL)[3-4]，但日本規(guī)定了恩拉霉素在豬、雞的可食性組織(肌肉、肝臟、腎臟和脂肪)中的MRL為30 μg/kg[5]。為保障我國動物性食品安全和促進國際貿易，迫切需要建立快速準確的動物性食品中恩拉霉素的檢測方法。

目前已建立的生物材料中恩拉霉素的分析方法相對較少，分析對象主要為飼料，少數為動物性食品，分析手段有微生物法[6-7]、薄層色譜法[8]、液相色譜法[9]和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[5,10-11]；恩拉霉素人工抗原方面的研究亦有一定報道[12-13]，但未見相關免疫分析方法的報道。而動物性食品中恩拉霉素的分析方法多為液相色譜-串聯質譜法，分析對象為雞肉[5,10]和豬肉[11]，待測物均為恩拉霉素A和恩拉霉素B，目前尚未見有關動物肝臟中恩拉霉素的分析方法報道；所建方法均采用固相萃取進行凈化，凈化小柱有Waters Oasis HLB、Agilent Bond Elut ENV以及IRISTMPolymeric SPE，前處理較復雜，且Boison等[5]建立的方法對雞肉中恩拉霉素A和恩拉霉素B的定量下限分別為66 μg/kg和50 μg/kg，無法滿足相關殘留限量的要求。本研究利用恩拉霉素易溶于稀鹽酸的特點，建立了稀鹽酸-乙腈混合溶液提取，有機溶劑液液萃取凈化，LC-MS/MS分析豬肝臟中恩拉霉素的方法。該方法具有簡單、快速、準確和靈敏的特點，能滿足相關殘留監(jiān)控的需要。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters UPLC超高效液相色譜儀、XevoTMTQ-S micro串聯質譜儀(美國Waters公司)，配置電噴霧離子源；Ultra-Tyrrax T25型勻質器(德國IKA公司)；低溫高速離心機(德國Sigma公司)。

恩拉霉素A和恩拉霉素B均由安徽普洛生物科技有限公司提供，含量分別為98.6%和92.3%。甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；鹽酸、乙酸乙酯和正己烷(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 色譜及質譜條件

色譜條件：色譜柱為Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；梯度洗脫條件：在0.5 min內保持80%A，然后在2.5 min內線性降至25%A，保持2 min后在0.1 min內線性升至80%A，保持1.9 min。

質譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子模式電離；檢測方式為多反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓為2.0 kV；萃取錐孔電壓為25 V；RF透鏡電壓為0.5 V；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣溫度為500 ℃；錐孔氣流速為50 L/h；脫溶劑氣流速為1 000 L/h；其它條件見表1。

表1 恩拉霉素A和恩拉霉素B的保留時間、母離子、子離子、錐孔電壓及碰撞能量Table 1 Retention times,precursor ions，product ions，cone voltages and collision energies of enramycin A and enramycin B

*quantitative ion

1.3 樣品前處理

稱取試樣2.5 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸-乙腈(3∶7，體積比)，以10 000 r/min均質1 min，再以9 500 r/min離心5 min后，取上清液，相同條件下重復提取1次，合并提取液，依次加入8 mL乙酸乙酯和2 mL正己烷，渦旋1 min后以5 000 r/min離心2 min，取下層水相(約6.5 mL)，用0.1%甲酸定容至10 mL，過0.22 μm濾膜后，供LC-MS/MS測定。

1.4 加標回收實驗

利用經測定不含恩拉霉素的豬肝臟樣品進行加標實驗，樣品處理與“1.3”方法相同，恩拉霉素A和恩拉霉素B的加標濃度為15、30、60 μg/kg。樣品稱樣后加入標準溶液，渦旋混勻放置0.5 h后進行樣品處理。

1.5 精密度實驗

按照“1.4”進行空白加標實驗，每一加標濃度進行3批次實驗，每批次5個平行樣品，計算批內相對標準偏差(RSD)及批間RSD。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

多肽類抗生素因結構上含有氨基基團而在正離子模式下易帶正電荷，且易帶2個或3個電荷[5]。本實驗用0.1%甲酸溶液-甲醇(80∶20，體積比)分別配制1.0 mg/L的恩拉霉素A和恩拉霉素B單標溶液，發(fā)現相同條件下恩拉霉素A和恩拉霉素B帶3個電荷的準分子離子峰的響應分別約為帶2個和4個電荷準分子離子峰響應的50倍和10倍，因此優(yōu)化得到帶3個電荷的準分子離子峰的質譜條件(表1)。其中定量離子對(m/z786.0>95.0和m/z790.8>95.0)與文獻報道相同[5,10-11]，本方法選擇的定性離子為m/z1 089.0，與文獻[5]中恩拉霉素B的定性離子一致。

采用超高效液相色譜常用的Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)在“1.2”的梯度條件下，對比了水相中甲酸濃度為0.1%、0.2%和0.4%，有機相為甲醇或乙腈時恩拉霉素A和恩拉霉素B的分離效果，發(fā)現恩拉霉素A和恩拉霉素B在甲酸為0.1%時的響應和信噪比均最好；且有機相為甲醇時，恩拉霉素A和恩拉霉素B的響應比有機相為乙腈時高70%左右，信噪比約高40%，因此確定以0.1%甲酸溶液-甲醇為流動相。

圖1 不同體積比0.1 mol/L鹽酸和乙腈混合溶劑對恩拉霉素提取回收率的影響(加標200 μg/kg)Fig.1 Effects of different volume ratio for 0.1 mol/L HCl- acetonitrile on recoveries of enramycin (added 200 μg/kg) volume ratio of 0.1 mol/L HCl to acetonitrile(1-5):5∶5, 4∶6,3∶7,2∶8,1∶9,respectively

2.2 前處理條件的優(yōu)化

目前多肽類抗生素常用的提取劑有甲醇[14]、甲醇-水[5,15-16]、鹽酸-乙腈[10-11]等。而恩拉霉素易溶于鹽酸，因此本研究按照“1.3”的方法對比了不同比例0.1 mol/L鹽酸和乙腈混合溶劑的提取效果(圖1)，發(fā)現0.1 mol/L鹽酸和乙腈的體積比為3∶7、4∶6和5∶5時的提取回收率均高于92.0%，且差異較?。煌瑫r經研究發(fā)現乙腈比例越高，基質效應越小，因此本研究采用0.1 mol/L鹽酸-乙腈(3∶7)作為提取溶劑。

對于動物性食品中多肽類抗生素的凈化目前多采用固相萃取法，萃取小柱主要有HLB、PLS、Strata-X、Bond Elut ENV和IRISTMPolymeric SPE等[5,10-11,14-16]。考慮到恩拉霉素易溶于鹽酸，本研究嘗試在提取液中加入有機溶劑采用液液萃取凈化提取液，結果發(fā)現按“1.3”步驟得到的加標樣品提取液中加入8 mL乙酸乙酯渦旋后，水相和有機相分層較好，但由于分層后水相體積較少(約2.5 mL)，回收率(n=3)只有(42±2)%左右；而固定加入8 mL乙酸乙酯，同時加入不同體積(1、2、3 mL)正己烷時的回收率(n=3)分別為(65±3)%、(83±4)%和(82±4)%。當正己烷體積從1 mL增至2 mL時，上層溶液的極性逐漸變弱而導致更多水從上層析出，下層水相體積從2.5 mL增至6.5 mL左右，最終導致回收率逐漸增加；當正己烷體積從2 mL增至3 mL時，下層水相體積基本不變，回收率變化也較小，因此選擇加入2 mL正己烷。同時對直接提取進樣、液液萃取、ENV固相萃取凈化(按“1.3”提取，氮吹至無有機相后按文獻[10]操作)的基質效應(以基質標準曲線斜率和溶劑標準曲線斜率之比表示)進行研究，發(fā)現液液萃取凈化的基質效應得到了明顯改善，與固相萃取凈化的基質效應差異較小，但操作更加簡單快速，且空白樣品無雜質干擾(圖2A)；同時最終上樣溶液經樣品提取凈化等步驟處理后，含鹽酸濃度約為0.06 mol/L，且僅作為進樣溶液未作為流動相，大量進樣(方法研究和實際樣品分析)后未發(fā)現對ESI源的噴霧電流和ESI污染有明顯影響，因此采用加入乙酸乙酯和正己烷液液萃取的方法進行樣品凈化。

2.3 線性實驗

在經“1.3”處理的空白樣品下層凈化液中加入適量恩拉霉素A和恩拉霉素B標準溶液，配制2.0、10、20、50、100、200、500 μg/L系列基質匹配標準工作溶液進行LC-MS/MS分析，以定量離子對峰面積(Y)對質量濃度(X，μg/L)作標準曲線。結果表明，恩拉霉素A和恩拉霉素B在2.0～500 μg/L范圍內呈良好的線性關系，回歸方程分別為Y=89.6X+205(r2=0.998 9)和Y=97.8X+189(r2=0.997 8)。

2.4 方法的回收率、相對標準偏差與檢出限

按照“1.4”和“1.5”方法進行加標和精密度實驗，結果表明，恩拉霉素A和恩拉霉素B的平均回收率為80.8%～90.3%，批內RSD為0.90%～4.5%，批間RSD為3.0%～4.3%。分別以信噪比S/N=3和S/N=10計算檢出限和定量下限，恩拉霉素A和恩拉霉素B在豬肝臟中的檢出限分別為3.0、4.0 μg/kg，定量下限分別為10、12 μg/kg(表2)。本方法的靈敏度與文獻[10]相當，明顯優(yōu)于文獻[5]的方法靈敏度(恩拉霉素A和恩拉霉素B的定量下限分別為66、50 μg/kg)；同時本方法操作更簡便，單個樣品從前處理到分析僅需0.5 h左右，比現有方法耗時短(通常需1.5～3 h)?？瞻棕i肝臟樣品的加標回收MRM色譜圖見圖2B。

表2 豬肝臟中恩拉霉素的平均回收率、相對標準偏差、檢出限和定量下限Table 2 Average recoveries,relative standard deviations(RSD),the limits of detection(LOD) and the limits of quantitation(LOQ) of enramycin in swine liver

圖2 空白豬肝臟樣品(A)和加標樣品(B，15 μg/kg)的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of swine liver blank sample(A) and fortified sample(B,15 μg/kg)

2.5 方法應用

采用優(yōu)化后的樣品前處理方法和分析條件分別對采自寧波當地大型超市的22個豬肝臟樣品進行了分析，均未檢出恩拉霉素A和恩拉霉素B。

3 結 論

通過優(yōu)化樣品提取和儀器條件，建立了豬肝臟樣品中恩拉霉素A和恩拉霉素B同時分析的液相色譜-串聯質譜方法。樣品經0.1 mol/L鹽酸-乙腈(3∶7)提取后，通過加入有機溶劑液液萃取凈化即可滿足分析要求。經方法驗證，恩拉霉素A和恩拉霉素B在15、30、60 μg/kg加標濃度下，平均回收率為80.8%～90.3%，批內RSD為0.90%～4.5%，批間RSD為3.0%～4.3%，檢出限分別為3.0、4.0 μg/kg，定量下限分別為10、12 μg/kg。該方法簡單實用，能夠滿足實際殘留監(jiān)控的需要。