卡其百合的不定芽誘導(dǎo)及植株再生

李浩 劉玉超 黃子軒

摘要：采用卡其百合（Lillium spp. var. Khaki）的種球為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑，對外植體進行不定芽的誘導(dǎo)、生根及植株再生。對 6-BA、NAA、GA3、IBA及活性炭等成分的添加濃度及配比對卡其百合不定芽誘導(dǎo)及生根的影響進行了正交試驗。結(jié)果表明，不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基附加2.0 mg/L 6-BA、0.10 mg/L NAA和0.5 mg/L GA3，經(jīng)驗證其不定芽誘導(dǎo)率可達83.3%，芽較為粗壯，色嫩綠，褐化現(xiàn)象很少;不定芽生根的最佳培養(yǎng)基配方為1/2 MS附加0.1 mg/L NAA和0.1 mg/L IBA，經(jīng)驗證其生根率可達73.3%，每個不定芽生根數(shù)目較多，根較為粗壯，狀態(tài)良好。

關(guān)鍵詞：卡其百合;組織培養(yǎng);植物生長調(diào)節(jié)劑;不定芽

中圖分類號：Q813.1+2;S644.1 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）01-0149-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.034 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： With the bulbs of Lillium spp. var. Khaki as explants， MS medium plus different concentrations of plant growth regulators were used to inducing adventitious shoots and roots for plant regeneration. In this process， orthogonal experimental methods were used to analysis the impact of the concentrations and proportions of 6-BA， NAA， GA， IBA and active carbon to shoots and roots inducement of Lillium spp. var. Khaki. The results showed that the optimal medium for shoots inducement was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3. After retesting， it was proved that the ratio of shoots inducement was 83.3% and the shoots were strong， fresh green and less browning. The optimal medium for rooting of adventitious shoots was 1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA and the ratio of rooting was 73.3%. The number of roots for each adventitious shoot was higher. The roots were strong and in good condition.

Key words： Lillium spp. var. Khaki; tissue culture; plant growth regulator; adventitious shoot

百合是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium spp.）多年生球根花卉，其花朵碩大、花色豐富、花香宜人，具有較高的觀賞價值，深受人們喜愛。目前記載百合種類全世界約115種，中國原產(chǎn)約55種[1，2]。自20世紀80年代，中國已開始研究觀賞百合，然而高品質(zhì)、高觀賞價值的品種很少。國際上，以荷蘭和美國為中心，已育出上千種栽培品種，幾乎壟斷了國際百合種球市場[2]。因此，百合的種質(zhì)創(chuàng)新已成為中國百合花卉市場發(fā)展的重中之重。而植物組織培養(yǎng)技術(shù)被應(yīng)用于百合新品種選育、優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)、種植資源創(chuàng)新和保存等諸多方面。

卡其百合（Lillium spp. var. Khaki）是近年來國際上培育出的較新的栽培品種，具有花期長、抗病性強、成活率高等特點。試驗主要應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，建立卡其百合的快速繁殖體系，旨在為百合育種提供資料。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為新鮮的卡其百合種球，武漢市花卉市場購買。

1.2 ?主要儀器設(shè)備

高壓蒸氣滅菌鍋、超凈工作臺、光照恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 ?方法

1.3.1 ?外植體的制備與接種 ?將百合種球用自來水沖洗30 min，去除種球外部鱗片，留中間莖尖部分，移至超凈工作臺內(nèi)，75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3遍，2%次氯酸鈉溶液處理15 min，無菌水沖洗3遍，切取0.5～1.0 mm厚的薄片，接種到培養(yǎng)基中。

1.3.2 ?培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件

1）不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、NAA和GA3，另加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉，pH 5.8～6.0。

2）生根培養(yǎng)基。1/2 MS附加不同濃度的NAA、IBA和活性炭，3%蔗糖、0.7%瓊脂粉，pH 5.8～6.0。

3）培養(yǎng)條件。不定芽誘導(dǎo)期間，光照12 h/d，不定芽生根期間，光照16 h/d，其他條件均為25 ℃，光照度為1 000～2 000 lx。

1.3.3 ?煉苗與移栽 ?將根系發(fā)達、生長健壯的組培苗瓶子放置于自然光照和溫度下24 h，之后開蓋，室溫、弱光照條件下放置2 d后小心將其取出，用清水洗凈根系上的殘余培養(yǎng)基，放入潔凈小盤中自然陰干1～2 d，直到苗身稍微失水，再移栽于沙子﹕腐殖土為1∶1的混合基質(zhì)中，澆適量水，約7 d 后長出新根再澆1次水，以后每 3 d澆水1次。注意煉苗期間防止陽光直射和基質(zhì)過濕。

1.3.4 ?正交試驗 ?確定影響百合不定芽誘導(dǎo)和生根的因素各3個，分別設(shè)定3個水平（表1、表2），進行L9（34）正交試驗。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?百合不定芽誘導(dǎo)正交試驗結(jié)果

將百合種球莖尖外植體按照表1所示的正交設(shè)計進行試驗，接種在不同激素濃度配比的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個試驗接種30塊外植體，培養(yǎng)5～7 d即可見外植體組織膨大，20 d左右開始有不定芽生成，40 d左右大量不定芽形成，此時，將誘導(dǎo)情況進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，6-BA對百合不定芽誘導(dǎo)的影響最大，極差（R）為24.33，隨著6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)出不定芽的外植體量有所增加。但當6-BA濃度增加時，褐化現(xiàn)象也隨之增多，芽的數(shù)量雖多，卻極易產(chǎn)生硬結(jié)，色暗，很難再生，且易褐化。

NAA的添加也是必不可少的，其極差（R）為16.33，隨著濃度的增加，可有效促進不定芽的誘導(dǎo)，而與6-BA配合后，誘導(dǎo)效果更好，但隨著NAA添加量的增加，有少量愈傷組織產(chǎn)生，因此其添加濃度不宜過高。

GA3的添加對百合不定芽的誘導(dǎo)量并無明顯影響，其極差（R）最低，為7.67。然而，從芽的狀態(tài)上看，GA3可改善不定芽的伸長生長，且色澤嫩綠，隨著GA3濃度的提高，褐化現(xiàn)象也有所減少，因此，少量添加GA3對于不定芽的狀態(tài)調(diào)整有一定的幫助。

綜合不定芽誘導(dǎo)量及狀態(tài)是否良好等因素，最佳的激素組合為2.0 mg/L 6-BA、0.10 mg/L NAA和0.5 mg/L GA3。經(jīng)驗證得到不定芽誘導(dǎo)率可達83.3%，芽較為粗壯，色嫩綠，褐化現(xiàn)象少（圖1）。

2.2 ?百合不定芽生根正交試驗結(jié)果

百合不定芽誘導(dǎo)50 d左右，選取狀態(tài)良好的不定芽，切取下來接種在不定芽生根培養(yǎng)基中進行生根，每個試驗接種30個不定芽，10 d左右即有根生成，20 d時統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表4。由表4可知，NAA的添加對百合不定芽生根的影響極差（R）為42.20，為3個因素中最大的，隨著NAA濃度的增加，生根效果越好，根的數(shù)量明顯增加，狀態(tài)良好，然而濃度較高時，雖然根的數(shù)量較多，但同時會產(chǎn)生少量的愈傷組織，從而影響根的生長。IBA在生根時的作用不太明顯，極差（R）為17.77，濃度的增加也沒有明顯促進生根，但其添加對根的狀態(tài)調(diào)整有一定的效果，添加時會產(chǎn)生大量的毛狀根，根細長，色白嫩，因此添加少量的IBA可改善百合生根的質(zhì)量?；钚蕴康奶砑訉ι鶝]有明顯影響，極差（R）為15.57，對其生長的狀態(tài)也沒有太大調(diào)整作用，因此，可以考慮不添加。

綜合以上分析，確定最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS附加0.1 mg/L NAA和0.1 mg/L IBA，經(jīng)驗證生根率可達73.3%，每個不定芽生根數(shù)目較多，根較為粗壯，狀態(tài)良好。挑選長勢良好、生根數(shù)目較多的不定芽進行煉苗移栽，均已成活。

3 ?討論

在對卡其百合進行愈傷組織誘導(dǎo)的過程中，發(fā)現(xiàn)植物生長調(diào)節(jié)劑的添加是必不可少的。其中，6-BA對百合不定芽誘導(dǎo)的影響最大，這與夏九成等[3]的研究結(jié)果一致，在適宜濃度范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)出不定芽的外植體量有所增加，每塊外植體上誘導(dǎo)出的不定芽的數(shù)目也有所增加，但當6-BA濃度過高時，反而會抑制不定芽的誘導(dǎo)，且褐化現(xiàn)象也隨之增多，極易產(chǎn)生硬結(jié)，色暗，很難再生[4]。NAA的添加也是必不可少的，與6-BA配合后，可明顯提高不定芽的誘導(dǎo)量[5-8]，在本試驗中，NAA、6-BA和GA3合理配比后，不定芽誘導(dǎo)率可達83.3%，芽較粗壯，色嫩綠，褐化現(xiàn)象很少。GA3的添加，對百合不定芽的誘導(dǎo)量并無明顯影響，然而，從芽的狀態(tài)上看，GA3可改善不定芽的伸長生長，且色澤嫩綠，隨著GA3濃度的提高，褐化現(xiàn)象也有所減少。

不同外植體部位的誘導(dǎo)率也有很大不同，如馬怡迪等[9]、權(quán)永輝等[10]、李黛等[11]分別以百合種子、花絲、鱗片等作為外植體，研究其誘導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)不定芽誘導(dǎo)率鱗片>種子>花絲，鱗片在6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L激素培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)率高達91%，且芽的大小、數(shù)量以及生長情況良好。吳永輝等[12]、鄭思鄉(xiāng)等[13]、徐品三等[14]研究添加物對不同百合品種與多倍體百合誘導(dǎo)不定芽的影響時，發(fā)現(xiàn)激素6-BA、NAA對不同品種以及多倍體百合均有很好的誘導(dǎo)作用，活性炭可以減少培養(yǎng)基的污染，且蔗糖濃度的增加有助于芽的增殖，其中不定芽誘導(dǎo)率最高為80.21%，而在本試驗中，由于GA3可以促進幼苗莖的伸長生長，促進鱗莖提前萌發(fā)，經(jīng)過NAA、6-BA和GA3植物生長調(diào)節(jié)劑的合理配比后，不定芽誘導(dǎo)率最高可達93.3%，芽較為粗壯，色嫩綠，但是有褐化現(xiàn)象，后續(xù)通過添加活性炭等是否可以減少褐化現(xiàn)象，還有待研究。

參考文獻：

[1] 李守麗，石 ?雷，張金政，等.百合育種研究進展[J].園藝學(xué)報，2006，33（1）：203-210.

[2] 吳祝華，施季森，池 ?堅，等.觀賞百合資源與育種研究進展[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，30（2）：113-118.

[3] 夏九成，鄭 ?毅，呂 ?會，等.利用百合花器官誘導(dǎo)試管苗快繁技術(shù)研究[J].北方園藝，2013（1）：102-104.

[4] 薛曉娜，張延龍，牛立新.秦嶺野生宜昌百合的組織培養(yǎng)研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，35（6）：108-112.

[5] 王 ?月.百合高效再生體系建立及遺傳轉(zhuǎn)化初探[D].上海：上海交通大學(xué)，2009.

[6] 舒 ?寧.幾種云南野生百合資源調(diào)查引種及離體繁殖體系研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[7] 邊紅琳.雜交百合后代的組織培養(yǎng)[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2012.

[8] 趙 ?強.青島百合的組織培養(yǎng)研究[D].山東青島：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[9] 馬怡迪，李 ?岳，李丹青，等.巨球百合無菌播種影響因素的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，41（3）：271-275.

[10] 權(quán)永輝，劉雅莉，祁銀燕，等.百合愈傷組織的誘導(dǎo)及瞬時表達的研究[J].北方園藝，2013（16）：103-107.

[11] 李 ?黛，談 ?鋒.誘導(dǎo)百合鱗片芽的影響因子研究[J].種子，2004，23（11）：18-20.

[12] 吳永輝，豐 ?鋒.百合鱗莖不定芽誘導(dǎo)與增殖配方優(yōu)化[J].東南園藝，2014（1）：9-12.

[13] 鄭思鄉(xiāng)，章海龍，董志淵，等.東方百合多倍體誘導(dǎo)及種球繁育的研究[J].西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，26（3）：260-263.

[14] 徐品三，劉華夏.無病毒百合組培種球快速繁殖體系的建立[J].中國農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，25（9）：174-178.