李慶芝， 周奕華*， 陳 袁， 陸 菲， 錢(qián) 俊， 曹 晟

(1. 武漢大學(xué) 印刷與包裝系， 湖北 武漢 430279; 2. 武漢東湖學(xué)院， 湖北 武漢 430212)

1 引 言

比率型熒光傳感器是指利用兩種不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光材料構(gòu)建的具有雙發(fā)射特性的熒光傳感器，可以根據(jù)其熒光發(fā)射峰之比的變化確定目標(biāo)分析物含量的變化，具有精度高、成本低、易操作等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)和免疫分析等許多領(lǐng)域。

與僅使用單發(fā)射熒光傳感器易受到探針濃度、激發(fā)強(qiáng)度、儀器效率、測(cè)量條件等多種影響因素相比[1]，比率型熒光傳感器具有兩個(gè)熒光發(fā)射峰，可以根據(jù)兩個(gè)峰的熒光信號(hào)比對(duì)分析物含量進(jìn)行檢測(cè)，從而避免各種外部因素對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)的影響，并顯著提高檢測(cè)精度。此外，比率型熒光傳感器可實(shí)現(xiàn)熒光-比色雙模型檢測(cè)，利用熒光顏色的變化，建立便捷可視化傳感機(jī)制。還可以突破 “yes/no”的定性檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的可視化半定量檢測(cè)。另外，將比率型熒光傳感器與噴墨打印等方式相結(jié)合，制備紙基熒光傳感器，可以使檢測(cè)從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，并能通過(guò)滴涂或者浸泡等方法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、方便、可視化的檢測(cè)。

目前，大部分比率型熒光傳感器都使用傳統(tǒng)有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)。但有機(jī)染料具有易光漂白、量子產(chǎn)率低、發(fā)射帶寬、激發(fā)范圍窄等缺點(diǎn)；而半導(dǎo)體量子點(diǎn)可能含有鎘和硒等重金屬元素，其內(nèi)在的毒性、光閃爍現(xiàn)象、低水溶性和生物相容性等都限制了它的應(yīng)用范圍[2-3]。

碳點(diǎn)(Carbon dots,CDs)作為一種新型的熒光納米材料，以其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)、良好的生物相容性、綠色的制備過(guò)程和巨大的應(yīng)用潛力而備受關(guān)注，將替代傳統(tǒng)有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)得到推廣。近年來(lái)，有關(guān)利用CDs構(gòu)建比率型熒光傳感器的研究逐漸引起人們的關(guān)注，在國(guó)外已有報(bào)道[3-4]，但是目前國(guó)內(nèi)圍繞比率型CDs熒光傳感器的可視化檢測(cè)的綜述相對(duì)較少。因此，本文在前人的基礎(chǔ)上對(duì)比率型CDs熒光傳感器的檢測(cè)機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)的綜述，并對(duì)其在分析物檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行分類(lèi)總結(jié)。

2 CDs及其性質(zhì)

2004年，Scrivens等在用電弧放電法制備的單壁碳納米管提純時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)了尺寸在 1 nm 左右的熒光碳納米粒子[5]。2006 年，Sun 課題組首次明確地將納米級(jí)的碳粒子命名為CDs[6]。Zuo 等[7]、Yan等[8]、Tang等[9]都發(fā)表了基于CDs性質(zhì)的綜述，著重對(duì)CDs的原料選擇、制備方法、熒光機(jī)理等方面進(jìn)行總結(jié)。

從形態(tài)結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，CDs是直徑小于10 nm的準(zhǔn)球形顆粒，由碳核與表面基團(tuán)兩部分組成。碳核可以由 sp2雜化的石墨微晶碳構(gòu)成，也可以由 sp3雜化的無(wú)定型碳構(gòu)成。CDs易于實(shí)現(xiàn)表面功能化，表面常常有大量的羥基、羧基等官能團(tuán)。表面官能團(tuán)的種類(lèi)主要取決于 CDs 的合成方法以及所選擇的鈍化劑的種類(lèi)，通過(guò)選擇不同鈍化劑，可以合成油溶性和水溶性CDs[10]。

在制備方法上，CDs可以簡(jiǎn)單地由低成本、易得的前體制備，其原料來(lái)源豐富，并可以通過(guò)一系列簡(jiǎn)單的鈍化技術(shù)進(jìn)行改性。近年來(lái)，微波輔助法和水熱法已成為環(huán)境友好且操作簡(jiǎn)單的有效合成方法，被廣泛應(yīng)用于CDs的制備。

在性質(zhì)方面，CDs具有上轉(zhuǎn)換熒光性、低毒性以及良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)；此外，CDs的激發(fā)帶寬且連續(xù)，可實(shí)現(xiàn)“一元激發(fā)，多元發(fā)射”；CDs的熒光波長(zhǎng)可調(diào)，發(fā)射波長(zhǎng)可能會(huì)隨激發(fā)波長(zhǎng)的增加而逐漸紅移，表現(xiàn)出典型的“熒光紅移現(xiàn)象”；CDs熒光穩(wěn)定性高且抗光漂白，在持續(xù)激發(fā)以及儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)的情況下仍能保持穩(wěn)定；CDs在 260～320 nm 左右的 UV 區(qū)域具有強(qiáng)而窄的光學(xué)吸收，而在可見(jiàn)光區(qū)只有少量吸收，構(gòu)成紫外光區(qū)吸收的尾帶[11]。

在應(yīng)用方面，CDs因其優(yōu)良的熒光性質(zhì)，在生物成像、分析檢測(cè)、催化、藥物載體、光電設(shè)備等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。其中，CDs已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于分析物檢測(cè)領(lǐng)域，主要包括離子檢測(cè)、食品小分子檢測(cè)、農(nóng)藥污染物等的檢測(cè)。如對(duì)Hg2+[2]、 Cu2+[12]、Fe3+[13]及其他重金屬離子的檢測(cè)；S2-[14]、ClO-[15]等陰離子檢測(cè)；食品添加劑如日落黃[16-17]、檸檬黃[18-19]、亞硝酸鹽[20-21]、三聚氰胺[22-23]，常用抗生素[24-26],農(nóng)藥污染物如草甘膦[27]、敵敵畏[28]、有機(jī)磷農(nóng)藥等[29-30]的檢測(cè)；pH檢測(cè)[31-33]以及氣體污染物如H2S[34]和N2O[35]等的檢測(cè)等。

3 熒光檢測(cè)機(jī)理

CDs具有獨(dú)特的表面結(jié)構(gòu)，可以與待檢測(cè)物質(zhì)之間發(fā)生共價(jià)鍵結(jié)合作用、靜電相互作用、螯合反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)或能量轉(zhuǎn)移，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性或定量分析[36]，其光致發(fā)光及熒光猝滅機(jī)理總結(jié)如下。

3.1 光致發(fā)光機(jī)理

由于CDs內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面官能團(tuán)的不同，其發(fā)光現(xiàn)象也不同，目前關(guān)于CDs的熒光機(jī)理還尚在爭(zhēng)論當(dāng)中，沒(méi)有統(tǒng)一的說(shuō)法。 Zhi等[37]、Zhu等[38]都發(fā)表了關(guān)于CDs發(fā)光機(jī)理的綜述，對(duì)其發(fā)光機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)闡述。CDs光致發(fā)光機(jī)理可以簡(jiǎn)單總結(jié)為以下幾個(gè)方面：

(1)量子尺寸效應(yīng)

量子尺寸效應(yīng)是指當(dāng)CDs的納米尺寸減小到一定數(shù)值時(shí)，其價(jià)帶和導(dǎo)帶之間產(chǎn)生從連續(xù)能帶到離散能帶的變化或者帶隙隨著CDs納米尺寸的減小而增大的現(xiàn)象?？梢哉{(diào)節(jié)CDs的粒徑大小，使其在紫外-可見(jiàn)區(qū)產(chǎn)生帶隙躍遷，從而造成CDs熒光發(fā)射波長(zhǎng)的不同。

(2)表面缺陷態(tài)

CDs表面不同化學(xué)基團(tuán)和官能團(tuán)等存在能量勢(shì)阱，碳核受光激發(fā)后會(huì)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的電子，這些激發(fā)態(tài)的電子被CDs表面的基團(tuán)所捕獲從而導(dǎo)致CDs的熒光性能發(fā)生改變?；瘜W(xué)氧化法或其他有效的表面改性方法，如元素?fù)诫s等可以使CDs表面氧化程度增高，產(chǎn)生更多的表面缺陷，進(jìn)而調(diào)節(jié)CDs的熒光發(fā)射[36]。

(3)分子態(tài)

分子態(tài)發(fā)光通常是指CDs的熒光性質(zhì)高度依賴(lài)于其表面的分子殘留或者有機(jī)分子發(fā)光基團(tuán)，這些發(fā)光體可以附著在CDs骨架的表面，使CDs產(chǎn)生明亮的熒光發(fā)射，不同的合成條件和前驅(qū)體都會(huì)導(dǎo)致CDs熒光發(fā)射的不同。

3.2 熒光猝滅機(jī)理

根據(jù)猝滅方式的不同，CDs的熒光猝滅機(jī)理[11]可以總結(jié)為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)和內(nèi)濾效應(yīng)(Inner filter effect,IFE)四類(lèi)。

3.2.1 動(dòng)態(tài)猝滅

動(dòng)態(tài)猝滅是指激發(fā)態(tài)的CDs與猝滅劑碰撞回到基態(tài)，導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移或者電荷轉(zhuǎn)移的發(fā)生，從而使CDs熒光猝滅的過(guò)程。發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)，CDs的熒光壽命會(huì)隨猝滅劑是否存在而發(fā)生改變，而CDs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜則基本不受影響。另外，動(dòng)態(tài)猝滅容易受到溫度的影響，溫度升高時(shí)碰撞次數(shù)增加，進(jìn)而會(huì)增強(qiáng)動(dòng)態(tài)猝滅效應(yīng)的影響。

Thitarat等[39]以水葫蘆葉為前驅(qū)體，通過(guò)酸處理和熱解法合成了藍(lán)色發(fā)光的CDs。實(shí)驗(yàn)證明，硼砂溶液可以選擇性猝滅該CDs的熒光。此外，可將其用于硼砂檢測(cè)的便攜式紙基傳感器，檢測(cè)限為11.85 μmol/L，實(shí)現(xiàn)對(duì)食品樣品中硼砂含量的精確檢測(cè)。如圖1所示，通過(guò)測(cè)量不同溫度(10，30，50 ℃)下CDs-硼砂溶液的熒光發(fā)射，可以發(fā)現(xiàn)熒光猝滅與溶液溫度有關(guān)，且斜率(相當(dāng)于猝滅常數(shù))隨著溫度的升高而增大。表明隨著溫度的升高，CDs與硼砂之間的碰撞次數(shù)增加，證明了是動(dòng)態(tài)猝滅的結(jié)果。

圖1 不同溫度CDs-硼砂體系的熒光發(fā)射

Li等[30]通過(guò)水熱法制備CDs，如圖2所示，在乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)的催化下，乙酰膽堿(Acetylthiocholine,ATCh)可水解為硫代膽堿(Thiocholine,TCh),該反應(yīng)觸發(fā)比色探針2-硝基苯甲酸(2-nitrobenzoic acid, DTNB)分解，形成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acid,TNBA)。TNBA可以有效地猝滅CDs的熒光，而有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphorous pesticides, OPs)的加入會(huì)阻斷AChE的活性，導(dǎo)致CDs熒光的恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)OPs的快速檢測(cè)，檢測(cè)限為0.4 ng/mL。為了闡明其熒光猝滅機(jī)理，研究了存在和不存在AChE時(shí)CDs/DTNB/ATCh系統(tǒng)的熒光壽命，研究發(fā)現(xiàn)，CDs/DTNB/ATCh/AChE體系的熒光壽命比CDs/DTNB/ATCh體系的熒光壽命短，說(shuō)明是動(dòng)態(tài)猝滅的結(jié)果。此外，隨著溫度的升高，TNBA對(duì)CDs的熒光猝滅作用明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步說(shuō)明發(fā)生了動(dòng)態(tài)猝滅。

此外，Wang等[40]以櫻花為原料通過(guò)一步水熱法制備了水溶性良好的氮摻雜CDs(NCDs)，MnO4-可以使 NCDs的熒光發(fā)生猝滅，從而實(shí)現(xiàn)對(duì) MnO4-的快速檢測(cè)，檢測(cè)限為 0.15 μmol/L，該探針已成功應(yīng)用于實(shí)際水樣中微量 MnO4-的測(cè)定。研究發(fā)現(xiàn)，該NCDs的熒光壽命隨著MnO4-濃度的增大而明顯減小，而紫外-可見(jiàn)吸收光譜則基本不受其影響，證明發(fā)生了動(dòng)態(tài)猝滅。

圖2 OPs檢測(cè)機(jī)理示意圖

3.2.2 靜態(tài)猝滅

CDs和猝滅劑之間相互作用形成無(wú)熒光的基態(tài)絡(luò)合物、且使CDs熒光猝滅的現(xiàn)象稱(chēng)為靜態(tài)猝滅[41]。靜態(tài)猝滅有以下特點(diǎn)：猝滅劑存在時(shí)，CDs的熒光壽命幾乎不變；基態(tài)絡(luò)合物的形成可導(dǎo)致CDs紫外-可見(jiàn)吸收光譜的變化；溫度的升高會(huì)阻礙這類(lèi)絡(luò)合物的形成或降低其穩(wěn)定性，進(jìn)而降低靜態(tài)猝滅效應(yīng)的影響。

Chen等[42]采用水熱法制備了藍(lán)綠色的氮摻雜CDs(NCDs)，并將橙紅色熒光染料溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)作為熒光參考信號(hào)引入到該體系中，制成N-CDs/EB熒光傳感器。由于NCDs表面帶正電荷的含氮基團(tuán)可以通過(guò)靜電作用和氫鍵與帶負(fù)電荷的全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonic acid,PFOS)反應(yīng)，導(dǎo)致CDs的熒光猝滅，且隨著PFOS濃度的增加，N-CDs/EB熒光傳感器的顏色由綠色變?yōu)槌壬?，檢測(cè)限低至27.8 nmol/L，因而可用于水樣中PFOS的檢測(cè)。為了解釋PFOS熒光猝滅機(jī)理，分別對(duì)有無(wú)PFOS存在時(shí)N-CDs的熒光壽命曲線(xiàn)進(jìn)行擬合。研究發(fā)現(xiàn)，加入PFOS前(15.33 ns)與加入PFOS后(15.15 ns)，熒光壽命沒(méi)有明顯下降，因此認(rèn)為PFOS對(duì)N-CDs的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。

此外，Xu等[19]以蘆薈為碳源，采用水熱法制備了黃色熒光發(fā)射CDs，檸檬黃的存在可以選擇性地猝滅CDs的熒光。而CDs熒光強(qiáng)度的降低使得在0.25～32.50 μmol/L的線(xiàn)性范圍內(nèi)測(cè)定檸檬黃成為可能，該方法已成功地應(yīng)用于某些食品樣品中檸檬黃的測(cè)定。由于其熒光猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小且有基態(tài)配合物的形成，證明發(fā)生了靜態(tài)猝滅。

3.2.3 FRET

FRET是指熒光傳感器中能量供體和能量受體之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的過(guò)程，供體熒光分子從激發(fā)態(tài)躍遷回到基態(tài)，誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。其特性有：供體分子的熒光發(fā)射光譜和受體分子即猝滅劑的吸收光譜之間需要具有一定的光譜重疊,且供體分子與猝滅劑之間的距離必須足夠近，一般7～10 nm。

Liu等[43]通過(guò)熱解法制備了有機(jī)硅功能化CDs，將其與二氧化硅包覆的CdSe量子點(diǎn)(CdSe@SiO2)通過(guò)Si—O鍵連接起來(lái)，制備了熒光傳感器CdSe@SiO2/CDs。并通過(guò)簡(jiǎn)單的溶膠-凝膠聚合方法，將分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer,MIP)層固定在該熒光傳感器上，制備了分子印跡聚合物CdSe@SiO2/CDs/MIP。如圖3所示，由于作為受體的4-硝基苯酚(4-Nitrophenol,4-NP)的吸收光譜與作為供體的CDs的發(fā)射光譜之間重疊，認(rèn)為CDs和4-NP之間發(fā)生了FRET過(guò)程，使得CDs的藍(lán)色熒光猝滅，而該體系中CdSe@SiO2的熒光強(qiáng)度保持相對(duì)不變,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)4-NP濃度的快速檢測(cè)，檢測(cè)限為0.026 μg/mL。

Li等[44]通過(guò)水熱法合成了同時(shí)摻雜N、S元素的熒光CDs(N,S-CDs)，并利用其與維生素 B2組成FRET體系，建立了便捷檢測(cè)菇類(lèi)食品中維生素 B2含量的方法，檢測(cè)限為5.0×10-8mol/L。由于作為供體的N、S-CDs的發(fā)射光譜與受體維生素B2的吸收光譜有非常好的重疊，且隨著維生素B2的加入，N,S-CDs的熒光逐漸被猝滅，而維生素B2的熒光強(qiáng)度逐漸增大，證明N,S-CDs 和維生素B2之間發(fā)生了FRET過(guò)程。

圖3 4-NP的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和CDs的熒光發(fā)射光譜

Mao等[45]構(gòu)建了一種基于CDs改性的納米多孔氧化鋁膜和Fe3O4@Au磁性納米復(fù)合材料的FRET檢測(cè)體系，用于鯖魚(yú)組胺的檢測(cè)。以固定在多孔氧化鋁膜上的CDs作為供體分子， Fe3O4@Au磁性納米復(fù)合材料不僅可以作為受體分子，還起到富集魚(yú)的組胺的作用。當(dāng)Fe3O4@Au磁性納米復(fù)合材料靠近CDs時(shí)，由于發(fā)生了FRET，CDs的熒光發(fā)射被轉(zhuǎn)移到Fe3O4@Au磁性納米復(fù)合材料上并被猝滅，檢測(cè)限為70 pmol/L，可用于監(jiān)測(cè)不同貯存條件下魚(yú)類(lèi)的腐敗過(guò)程。

3.2.4 IFE

IFE是指當(dāng)溶液中存在能吸收熒光物質(zhì)的激發(fā)光或發(fā)射光的物質(zhì)時(shí)，體系內(nèi)熒光減弱甚至猝滅的現(xiàn)象。IFE過(guò)程有以下特點(diǎn)：CDs的激發(fā)光譜或者發(fā)射光譜與猝滅劑的吸收光譜重疊；在該過(guò)程中沒(méi)有形成新物質(zhì)，因此CDs的吸收光譜不會(huì)改變，且CDs的熒光壽命不變。

Dong等[46]通過(guò)水熱法合成熒光CDs，并利用辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)催化3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯(3, 3′, 5, 5′-tet-ramethylbenzidine,TMB)生成藍(lán)色吸光物質(zhì) TMBbox。由于TMBox的吸收光譜與CDs的熒光激發(fā)光譜重疊，認(rèn)為發(fā)生了IFE，使得CDs熒光猝滅，其檢測(cè)限為0.02 ng/mL，已成功地應(yīng)用于檢測(cè)雞中金剛烷胺(Amantadine,AMD)殘留量。如圖4所示，對(duì)CDs在熒光猝滅之前(紅色，5.19 ns)和之后(藍(lán)色，5.11 ns)的熒光壽命進(jìn)行檢測(cè)，證明TMBox的存在對(duì)CDs的熒光壽命無(wú)影響。通過(guò)超濾將CDs與猝滅劑分離，會(huì)使CDs被猝滅的熒光恢復(fù)，表明不存在非熒光配合物的生成，進(jìn)一步證明了CDs的熒光猝滅是發(fā)生了IFE的原因。

圖4 IFE 猝滅效應(yīng)前后CDs的熒光壽命

此外，Wang等[27]利用微波輔助一步熱解法從羊毛中制備CDs，其熒光能被基于IFE的銀納米粒子(Silver nanoparticles,AgNPs)猝滅，而草甘膦的存在可以誘導(dǎo)AgNPs的聚集，從而導(dǎo)致猝滅CDs的熒光恢復(fù)。建立了CDs與AgNPs之間的IFE體系，檢測(cè)限低至12 ng/mL，該方法已用于谷物樣品中草甘膦的檢測(cè)。

4 比率型CDs熒光傳感器

如表1所示，根據(jù)CDs使用情況的不同，將比率型CDs熒光傳感器在檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用分為兩類(lèi):第一類(lèi)為僅使用不同熒光發(fā)射的CDs進(jìn)行檢測(cè)，第二類(lèi)為將CDs與其他熒光發(fā)射體合成納米復(fù)合探針進(jìn)行檢測(cè)。下面將分別對(duì)其進(jìn)行介紹。

4.1 僅用CDs

僅用CDs檢測(cè)可以有效避免與其他熒光發(fā)射體合成納米復(fù)合探針時(shí)，可能需要對(duì)CDs進(jìn)行表面修飾，甚至需要復(fù)雜的分離純化等步驟，造成實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁雜、耗時(shí)等問(wèn)題。因此，設(shè)計(jì)和研究?jī)H用CDs檢測(cè)的比率型熒光傳感器具有十分重要的意義。

4.1.1 兩種熒光CDs進(jìn)行檢測(cè)

當(dāng)僅用CDs檢測(cè)時(shí)，常常使用兩種熒光發(fā)射的CDs進(jìn)行檢測(cè)，以其中一種熒光CDs的發(fā)射峰作為熒光響應(yīng)信號(hào)，另一種作為參考信號(hào)。

表1 比率型CDs熒光傳感器在檢測(cè)領(lǐng)域研究進(jìn)展

Liu等[12]分別通過(guò)水熱法制備了藍(lán)色CDs(b-CDs)和紅色CDs(r-CDs)，并將兩種CDs以7∶1的熒光強(qiáng)度混合，制成雙發(fā)射熒光傳感器。如圖5所示，隨著Cu2+的加入，產(chǎn)生了從藍(lán)色到橙色紅色的連續(xù)的熒光顏色變化。由于合成r-CDs表面殘留的對(duì)苯二胺有效地結(jié)合Cu2+，在400～640 nm之間產(chǎn)生一種強(qiáng)烈的可見(jiàn)吸收，因其與b-CDs的發(fā)射峰重疊，認(rèn)為發(fā)生了FRET過(guò)程，使藍(lán)色熒光發(fā)生猝滅；另一方面，較小的b-CDs通過(guò)Cu2+的雙配位作用吸附在較大的r-CDs的表面上，特定的光譜能量可以從b-CDs轉(zhuǎn)移到r-CDs上，進(jìn)而猝滅了b-CDs的熒光。這兩種機(jī)制導(dǎo)致了特定的光譜能量轉(zhuǎn)移，使b-CDs的熒光猝滅，而r-CDS的紅色熒光不受影響，形成穩(wěn)定的參考標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)限低至25 nmol/L。

圖5 銅離子加入時(shí)比率型熒光探針的熒光光譜

Liu等[47]以桂花葉為碳源，采用不同的溶劑萃取法制備了兩種顏色CDs。將藍(lán)色熒光發(fā)射CDs(bCDs)包裹在SiO2中作為熒光參考信號(hào)，防止bCDs與四環(huán)素(Tetracycline,TC)的直接相互作用。并將紅色熒光發(fā)射CDs(rCDs)作為響應(yīng)信號(hào)，嵌入分子印跡聚合物層中，構(gòu)建了分子印跡比率熒光傳感器(MIPs@rCDs/bCDs@SiO2)。隨著TC含量的增加，rCDs的熒光被猝滅，而bCDs的熒光保持不變，出現(xiàn)由紫色到藍(lán)色的熒光顏色變化，檢測(cè)限為1.19 nmol/L，已成功應(yīng)用于當(dāng)?shù)睾铀妥詠?lái)水中TC含量的測(cè)定。

4.1.2 本征多發(fā)射CDs進(jìn)行檢測(cè)

本征多發(fā)射是指所制備的CDs表面可能含有多種官能團(tuán)，并形成多個(gè)表面狀態(tài)，在單一激發(fā)波長(zhǎng)作用下有兩個(gè)甚至多個(gè)可分辨熒光發(fā)射峰。本征多發(fā)射CDs傳感器的構(gòu)建為同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)分析物提供了可能。

Jiang等[49]以間氨基苯酚和草酸為原料，通過(guò)水熱法制備了雙發(fā)射CDs，在350 nm的光激發(fā)下，CDs顯示藍(lán)色和綠色的雙發(fā)射熒光，在CDs水懸浮液中加入AgNPs后，由于發(fā)生了IFE，藍(lán)色熒光發(fā)射強(qiáng)度不斷下降。之后，在CDs/AgNPs混合物的水懸浮液中加入殺菌劑霜脲氰(Cymoxanil, Cym)，由于靜電吸引和氫鍵作用，使AgNPs聚集，導(dǎo)致綠色熒光發(fā)生IFE，而藍(lán)色熒光恢復(fù)。該方法已應(yīng)用于天然河水、土壤和植物表皮中Cym的測(cè)定，檢測(cè)限為2 nmol/L。

Song等[50]采用一鍋水熱碳化法制備了雙發(fā)射CDs，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm時(shí)，該CDs在440 nm和624 nm處顯示出兩個(gè)明顯的熒光發(fā)射峰。如圖6所示，賴(lài)氨酸可以通過(guò)表面鈍化作用增強(qiáng)440 nm處CDs的熒光發(fā)射強(qiáng)度，而624 nm處的峰值保持不變，檢測(cè)限為94 nmol/L。另外，由于碳骨架結(jié)構(gòu)中摻雜N的質(zhì)子化以及表面基團(tuán)的去質(zhì)子化作用，624 nm處CDs的熒光信號(hào)對(duì)1.5～5.0范圍內(nèi)的pH值敏感，而440 nm處的熒光強(qiáng)度對(duì)其不敏感，紫外光照射下的紅色熒光發(fā)射會(huì)隨pH值的增加而逐漸減弱。該傳感器已被成功地應(yīng)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞中賴(lài)氨酸和pH值的動(dòng)態(tài)變化。

圖6 賴(lài)氨酸和pH的比率熒光傳感檢測(cè)

此外，Nguyen等[51]合成了一種具有本征多發(fā)射特性的高靈敏比率型傳感CDs，并將其用于溫度測(cè)量。利用乙二胺激光燒蝕制備CDs，其表面生成了大量的含氮、含氫、含氧表面官能團(tuán)，這些表面官能團(tuán)可能在表面位置形成多個(gè)表面狀態(tài)，導(dǎo)致CDs的多個(gè)發(fā)射。所制備的CDs在單波長(zhǎng)激發(fā)下表現(xiàn)出優(yōu)異的溫度比率傳感特性，在較寬范圍溫度(5～85 ℃)下，每攝氏度比率響應(yīng)變化1.48%，實(shí)現(xiàn)了很高的溫度靈敏傳感。該比例傳感器具有良好的可逆性和穩(wěn)定性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)溫度的精確測(cè)量，具有很大應(yīng)用前景。

4.2 納米復(fù)合探針

納米復(fù)合探針通過(guò)CDs和其他熒光納米材料簡(jiǎn)單混合或通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接來(lái)構(gòu)建比率型熒光探針。其中，常見(jiàn)的熒光材料有：有機(jī)染料[21,59]、金屬配位絡(luò)合物[58]、金屬有機(jī)框架(MOF)[48,60]、Ⅱ/Ⅵ和Ⅲ/Ⅴ半導(dǎo)體納米熒光團(tuán)[53]、金屬納米團(tuán)簇(NCs)[34,55]等。此時(shí)，CDs常常作為參考信號(hào)、響應(yīng)信號(hào)、能量供體或雙發(fā)射熒光傳感器的基質(zhì)。

4.2.1 CDs作為參考信號(hào)

在基于CDs的比率熒光探針中，CDs常被用作對(duì)分析物不敏感的參考信號(hào)。如果參考信號(hào)對(duì)分析物不是完全惰性的，為了保證參考信號(hào)的穩(wěn)定，常常將參考信號(hào)封裝到二氧化硅顆粒中；而響應(yīng)信號(hào)被嫁接到二氧化硅表面，并通過(guò)適當(dāng)?shù)倪B接物或通過(guò)熒光團(tuán)表面的官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，將參考和響應(yīng)信號(hào)連接在一起。

Yan等[52]設(shè)計(jì)并合成了一種檢測(cè)NO2分子的雙發(fā)射熒光傳感器。該熒光傳感器由藍(lán)色熒光CDs和紅色熒光量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)通過(guò)共價(jià)鍵構(gòu)筑而成，如圖7所示，其發(fā)射中心分別位于460 nm和665 nm處，其中藍(lán)色熒光的CDs對(duì)目標(biāo)分析物NO2不敏感，形成穩(wěn)定的熒光參考信號(hào)。而NO2可以通過(guò)氧化紅色熒光QDs表面的硫離子，破壞其鈍化保護(hù)層結(jié)構(gòu)，使紅色的QDs選擇性地被NO2猝滅，并導(dǎo)致探針熒光顏色產(chǎn)生從紅色到藍(lán)色的明顯變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)NO2敏感的可視化檢測(cè)。該方法對(duì)溶液中NO2的檢測(cè)限為19 nmol/L，為NO2氣體的快速、實(shí)時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了可能。

圖7 納米混合探針結(jié)構(gòu)示意圖及NO2的視覺(jué)檢測(cè)原理

Wen等[34]利用銅納米團(tuán)簇(Copper nanoclusters,CuNCs)和CDs通過(guò)靜電組裝制成雙發(fā)射納米復(fù)合材料，并將其作為檢測(cè)硫化物和氣態(tài)硫化氫的比率型熒光探針。如圖8所示，藍(lán)色熒光CDs作為熒光參考信號(hào)，紅色熒光的CuNCs作為熒光響應(yīng)信號(hào)，CuNCs暴露于硫化物后，由于與硫化物發(fā)生反應(yīng)而形成CuS，導(dǎo)致CuNCs的紅色熒光猝滅，而CDs的藍(lán)色熒光保持恒定。體系的熒光從紅色變?yōu)樗{(lán)色，檢測(cè)限為3.3×10-10(4.3 nmol/L)。CuNCs-CDs還被應(yīng)用于瓊脂凝膠中制成熒光濾紙，用于氣態(tài)硫化氫的熒光檢測(cè)。

圖8 硫化物加入時(shí)Cu-NCsCDs的熒光光譜

Zhou等[53]將青色CDs和紅色CdTe量子點(diǎn)以發(fā)射強(qiáng)度為1∶5混合，制備了雙發(fā)射熒光傳感器GSH/DTT-QDs/CDs。其中，CdTe量子點(diǎn)作為熒光響應(yīng)信號(hào)，CDs為參考信號(hào)。如圖9所示，As(Ⅲ)加入時(shí)，形成的As—S鍵誘導(dǎo)GSH/DTT量子點(diǎn)聚集體，使紅色熒光猝滅，而藍(lán)色熒光保持不變，溶液的熒光顏色逐漸從紅色變?yōu)榍嗌Ｍㄟ^(guò)印刷GSH/DTT-QDs/CDs墨水制備了熒光檢測(cè)試紙，在添加了As(Ⅲ)后，顯示出從桃紅色到粉紅色、再到黃綠色、最后到青色的一系列顏色演變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)As(Ⅲ)的超靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限低至5×10-9。

圖9 As(Ⅲ)加入時(shí)GSH/DTT-QDs/CDs的熒光光譜

此外， Rong等[54]以檸檬酸和硝酸銪為碳源和銪源熱解合成了Eu-CDs，并以Eu-CDs的藍(lán)色熒光作為熒光參考信號(hào)，用吡啶-2,6-二羧酸(2,6-dipicolinic acid,DPA)敏化Eu(Ⅲ)激發(fā)的紅色熒光作為熒光響應(yīng)信號(hào)，在紫外光激發(fā)和DPA的配位作用下，DPA敏化鑭系離子的熒光強(qiáng)度增加；而隨著DPA添加量的增加，水分子被DPA取代，并在Eu-CDs中與Eu(Ⅲ)配位，Eu-CDs的藍(lán)色熒光被抑制，產(chǎn)生由藍(lán)變紅的顏色變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)炭疽生物標(biāo)志物DPA的半定量檢測(cè)，檢測(cè)限為5 nmol/L。此外，用紫外線(xiàn)燈和智能手機(jī)分析其顏色變化，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際樣品中DPA的便攜可視化檢測(cè)。

4.2.2 CDs作為響應(yīng)信號(hào)

當(dāng)CDs作為對(duì)分析物靈敏的熒光響應(yīng)信號(hào)時(shí)，需要另一個(gè)熒光穩(wěn)定的熒光量子點(diǎn)作為參考信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)比率型熒光檢測(cè)。

He等[55]采用水熱法制備了藍(lán)色熒光CDs，并與3-氨基苯硼酸(3-aminophenylboronic acid, APBA)復(fù)合制備了APBA改性CDs。另外，以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)為穩(wěn)定劑，以N2H4·H2O為還原劑，制備了BSA穩(wěn)定的紅色熒光CuNCs。通過(guò)碳二亞胺活化偶聯(lián)，構(gòu)建了由CDs和CuNCs組成的新型納米雜化體，該雜化體顯示出在440 nm和640 nm處的雙發(fā)射熒光。其中，多巴胺(Dopamine,DA)作為電子受體，通過(guò)CDs向DA的電子轉(zhuǎn)移引起CDs在440 nm處的熒光猝滅，而B(niǎo)SA穩(wěn)定的CuNCs在640 nm處的熒光發(fā)射幾乎沒(méi)有變化，因此可以作為熒光參考信號(hào)，構(gòu)建用于有效檢測(cè)人血清樣品中DA含量的比率型熒光探針，檢測(cè)限低至32 nmol/L。

Xu等[2]制備了藍(lán)色發(fā)光CDs，并將其共價(jià)連接到含有紅色發(fā)射QDs的納米二氧化硅表面，得到雙發(fā)射納米探針，如圖10所示。二氧化硅包覆紅色發(fā)射量子點(diǎn)CdTe@SiO2對(duì)Hg(Ⅱ)是惰性的，可以提供可靠且恒定的參考信號(hào)。而藍(lán)色發(fā)射的CDs對(duì)Hg(Ⅱ)非常敏感，Hg(Ⅱ)加入時(shí)，可以通過(guò)動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩個(gè)過(guò)程猝滅CDs的熒光，隨著Hg(Ⅱ)濃度的增加，溶液的顏色呈現(xiàn)淺紫色到紅色的連續(xù)變化，其檢測(cè)限為0.47 nmol/L，可用于自來(lái)水中汞(Ⅱ)的可視化現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

圖10 CDs、CdTe@SiO2及雙發(fā)射探針熒光光譜。

4.2.3 CDs作為能量供體

CDs作為能量供體時(shí)，其能量常常通過(guò)FRET過(guò)程被其他熒光團(tuán)吸收，當(dāng)分析物加入時(shí)，會(huì)抑制或促進(jìn)CDs的FRET過(guò)程。根據(jù)兩個(gè)發(fā)射峰熒光強(qiáng)度之比的變化，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物含量的精確測(cè)定。

Yu等[56]合成了氨基包覆CDs，如圖11所示，將萘酰亞胺的疊氮化合物共價(jià)偶聯(lián)到CDs表面，構(gòu)建比率型熒光傳感器。在這種傳感器中，CDs不僅可以作為能量供體，還可以作為疊氮衍生物的錨定位點(diǎn)。H2S加入后，疊氮萘酰亞胺被H2S還原為能量受體,并在526 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的熒光發(fā)射帶。作為能量供體的CDs和能量受體之間發(fā)生FRET過(guò)程，導(dǎo)致425 nm 處CDs熒光猝滅，溶液的熒光由藍(lán)色變?yōu)榱辆G色。該FRET體系對(duì) H2S 具有很高的選擇性，檢測(cè)限為 10 nmol/L，可以實(shí)現(xiàn)水溶液、生物流體和活細(xì)胞中H2S的靈敏檢測(cè)。

圖11 CDs傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖及對(duì)H2S的比率檢測(cè)

Yan等[57]設(shè)計(jì)了一種新型熒光探針，用于水溶液中Cu2+的檢測(cè)，該探針以乙醛酸改性CDs(Glyoxylic acid-modified carbon dots,GA-CDs)為原料，通過(guò)酰胺化反應(yīng)，在其表面接枝7-二乙氨基香豆素-3-碳酰肼(7-diethylaminocoumarin-3-carbohydrazide，HCM)制備了雙發(fā)射熒光探針CMH-GA-CDs。在沒(méi)有Cu2+的情況下，CDs和 CMH之間會(huì)發(fā)生FRET過(guò)程，能量從CDs向CMH單元轉(zhuǎn)移，在340 nm激發(fā)下，CMH-GA-CDs分別在400 nm(CDs)和458 nm(CMH)處顯示出雙發(fā)射熒光。加入Cu2+后，由于Cu2+與摻雜原子N和O配位，會(huì)抑制FRET過(guò)程，使CDs熒光強(qiáng)度增大，CMH熒光強(qiáng)度降低，該方法可成功用于水樣中Cu2+的檢測(cè)，檢測(cè)限低至0.21 μmol/L。

4.2.4 CDs作為雙發(fā)射基質(zhì)

當(dāng)CDs作為雙發(fā)射基質(zhì)時(shí)，分析物的加入可以使兩個(gè)發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度同時(shí)發(fā)生改變，可能會(huì)使兩個(gè)熒光發(fā)射峰同時(shí)猝滅，或者一個(gè)增強(qiáng)另一個(gè)猝滅，可以通過(guò)其熒光發(fā)射比的變化構(gòu)建雙發(fā)射熒光傳感器。

Xiang等[21]將CDs包覆在摻雜羅丹明B(Rhodamine B,RhB)染料的二氧化硅納米粒子上，制備了基于CDs的雙發(fā)射二氧化硅納米傳感器。如圖12所示，在360 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下出現(xiàn)了兩個(gè)熒光發(fā)射峰，分別是CDs(460 nm)和RhB(572 nm)引起的發(fā)射。利用溴酸鉀(KBrO3)在硫酸中的強(qiáng)氧化作用可以猝滅雙發(fā)射二氧化硅納米粒子熒光，兩發(fā)射熒光強(qiáng)度之比和NO2-濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限為1.0 ng/mL，適用于不同食品樣品中亞硝酸鹽的測(cè)定。

圖12 CDs包覆的雙發(fā)射二氧化硅納米粒子溶液熒光光譜

Hu等[58]用水熱法合成了藍(lán)色熒光碳點(diǎn)(BCDs)，并以單磷酸胞苷(Cytidine monopho-sphate,CMP)和銪(Eu)組裝的鑭系配位聚合物為受體，以檸檬酸(cit)為輔助配體，制成比色熒光傳感器BCDs-Eu/CMP-cit，如圖13所示。在380 nm熒光激發(fā)下，隨著四環(huán)素(TC)的連續(xù)加入，BCDs在465 nm處由于發(fā)生IFE使熒光發(fā)射強(qiáng)度降低；而由于TC與Eu3+之間形成了穩(wěn)定的絡(luò)合物并產(chǎn)生向Eu3+的有效能量轉(zhuǎn)移，使620 nm處的熒光發(fā)射顯著增加，熒光顏色由亮藍(lán)色變?yōu)榧t色。此外，還制備了紙基熒光傳感器，隨著TC濃度的增加，試紙顯示出由亮藍(lán)色到紅色的顯著變化，檢測(cè)限為8 nmol/L，可實(shí)現(xiàn)食品中TC的快速可視化檢測(cè)。

圖13 BCDs-Eu/CMP-cit比值熒光探針的TC檢測(cè)示意圖

5 總結(jié)與展望

本文對(duì)比率型CDs熒光傳感器在檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，首先簡(jiǎn)述了CDs及其熒光性質(zhì)，然后詳細(xì)闡述了CDs的光致發(fā)光及熒光猝滅機(jī)理，同時(shí)根據(jù)CDs使用情況的不同，對(duì)比率型CDs熒光傳感器的分類(lèi)及其研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。大量研究表明，比率型CDs熒光傳感器具有抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全、小分子檢測(cè)、金屬離子檢測(cè)、環(huán)境污染物分析等許多領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。但是，另一方面，比率型CDs熒光傳感器的設(shè)計(jì)和構(gòu)建仍充滿(mǎn)挑戰(zhàn)：首先，發(fā)光機(jī)理的不明確限制了CDs的可控制備，尤其制約了雙發(fā)射或多發(fā)射CDs傳感器的設(shè)計(jì)；其次，CDs與其他熒光發(fā)射體結(jié)合構(gòu)建比率型熒光傳感器時(shí)，需要對(duì)CDs表面進(jìn)行修飾和分離純化，這不僅會(huì)造成實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)等問(wèn)題，而且可能會(huì)引入毒性、疏水基團(tuán)，對(duì)CDs的熒光性能和熒光產(chǎn)率產(chǎn)生影響；此外，目前比率型CDs傳感器的檢測(cè)主要是在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行的，具有一定的局限性；另外，檢測(cè)物與比率型CDs傳感器發(fā)生相互作用而構(gòu)成的可視化檢測(cè)系統(tǒng)，需要更加準(zhǔn)確的定量關(guān)系，其顏色變化與檢測(cè)物濃度關(guān)系是否能一一對(duì)應(yīng)，是否會(huì)導(dǎo)致中間復(fù)合色的形成等方面仍具有很大挑戰(zhàn)。

因此，對(duì)CDs發(fā)光和猝滅機(jī)理進(jìn)行更加深入的研究，合成不同尺寸和熒光發(fā)射可調(diào)的CDs以滿(mǎn)足分析檢測(cè)的需要，是比率型傳感器構(gòu)建的前提；對(duì)合成熒光團(tuán)或納米材料進(jìn)行選擇，研究和構(gòu)建更為簡(jiǎn)單、無(wú)毒且低成本的比率型CDs熒光傳感器是下一步研究的關(guān)鍵；對(duì)CDs的表面特性及實(shí)驗(yàn)參數(shù)和配比進(jìn)行分析優(yōu)化，提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，建立同時(shí)具有特定熒光響應(yīng)和精確比色特性的比率型CDs熒光傳感器，使其更適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要；利用噴墨打印等方式，制備CDs紙基熒光傳感器，使其更適用于工業(yè)化大批量生產(chǎn)的需要等，都是應(yīng)用比率型CDs熒光傳感器進(jìn)行可視化檢測(cè)需要進(jìn)一步探索和研究的方向。

隨著CDs發(fā)光機(jī)理、合成方法和傳感器制備技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，比率型CDs熒光傳感器必將在分析物檢測(cè)領(lǐng)域得到更廣泛、有效的應(yīng)用。