張 超，付三雄，唐 容，周小嬰，黃 莎，王璐璐，楊克相，戚存扣

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 貴州省油料研究所，貴陽(yáng) 550006；2.江蘇省農(nóng)科院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，南京 210014)

3-磷酸甘油脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)的主要作用是將糖酵解的中間產(chǎn)物磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetone phosphate, DHAP)加氫還原成甘油3磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)，是植物體內(nèi)G3P合成的限速酶之一[1-2]。在酵母和衣藻等微生物中的研究表明，GPDH在維持細(xì)胞內(nèi)的甘油平衡及促進(jìn)油脂，即三脂酰甘油(triacylglycerol, TAG)的合成方面具有重要作用[3-5]；在高等植物甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus L.)中過(guò)量表達(dá)酵母胞質(zhì)型GPD1基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜種子中TAG的合成量增加了40%，且糖酵解的中間產(chǎn)物DHAP迅速減少[6]，將種子特異表達(dá)的AtDGAT1和酵母胞質(zhì)型GPD1共表達(dá)載體轉(zhuǎn)到亞麻芥中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系種子含油量比野生型提高13%[7]。此外，近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)GPDH在調(diào)節(jié)滲透壓[8]、防御病原菌侵害[9]及增強(qiáng)對(duì)鹽分等逆境脅迫的適應(yīng)[10]方面也具有重要的作用。

在模式植物擬南芥中有5個(gè)GPDH基因，根據(jù)亞細(xì)胞定位分為3類，其中有2個(gè)基因?yàn)橘|(zhì)體型(plastidic glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDHp)，2個(gè)基因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)型(cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDHc)，另外1個(gè)則為線粒體型(mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDHm)[11-14]。AtGPDHm主要在線粒體膜上將G3P氧化成DHAP，與AtGPDHc協(xié)同作用形成G3P穿梭機(jī)制，維持細(xì)胞內(nèi)的G3P動(dòng)態(tài)平衡[12-13]，AtGPDHm在種子萌發(fā)時(shí)表達(dá)較高，并受ABA及逆境脅迫的影響[12]，在鹽生杜氏藻中發(fā)現(xiàn)鹽脅迫能夠促進(jìn)GPDHm的表達(dá)，而缺氧和低溫能夠抑制其表達(dá)[15]，推測(cè)GPDHm可以通過(guò)調(diào)控G3P氧化成DHAP這一釋放能量的代謝過(guò)程來(lái)應(yīng)對(duì)不同的脅迫條件。AtGPDHp的N端序列具有典型的葉綠體信號(hào)肽，且AtGPDHp與AtGPDHc的氨基酸序列差異較大[11]，在水稻中過(guò)量表達(dá)質(zhì)體型基因AtGLY1顯著提高了水稻質(zhì)體脂類的含量，而對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑合成的脂類含量沒(méi)有明顯影響[16]，可見(jiàn)GPDHp與GPDHc可能存在功能分化；另外，由于TAG的合成是在細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行的，相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)過(guò)量表達(dá)GPDHc能夠顯著促進(jìn)TAG合成[6-7]，表明GPDHc在參與種子存儲(chǔ)物質(zhì)TAG的合成中的作用更關(guān)鍵。

目前蓖麻[17]、水稻[18]、玉米[10, 19]的GPDH已有研究報(bào)道，在甘藍(lán)型油菜中也有部分GPDH被克隆和鑒定[20-21]，但針對(duì)BnGPDH家族的全基因組鑒定和分析尚未見(jiàn)報(bào)道，尤其是BnGPDHc與油菜種子TAG合成的關(guān)系尚不明確，因此，本研究利用已公布的甘藍(lán)型油菜參考基因組對(duì)BnGPDH進(jìn)行了全基因組鑒定，全面分析BnGPDH基因結(jié)構(gòu)、氨基酸保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化樹、染色體分布，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)的方法分析BnGPDHc在甘藍(lán)型油菜不同組織器官中的表達(dá)模式，并比較BnGPDHc在高、低含油量自交系材料中的表達(dá)差異，為研究BnGPDH在油菜種子TAG積累中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的甘藍(lán)型油菜高含油量自交系‘IL130’‘IL474’‘IL594’及低含油量自交系‘IL134’‘IL202’‘IL525’由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省油料研究所提供，2017-2018年度種植于貴陽(yáng)試驗(yàn)地，于盛花期標(biāo)記開放花朵，并取盛花期的根(Root)、莖(Shoot)、葉(Leaf)、花(Flower)、蕾(Bud)以及7、14、21、30、40DAF(day after flower)角果皮(Pericarp)和種子(Seed)，液氮速凍后，于-80 ℃保存，用于基因組織表達(dá)模式分析和差異表達(dá)分析。

1.2 甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)中GPDH基因的鑒定

在擬南芥TAIR(http://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站下載AtGPDH蛋白序列，利用BlastP[22]比對(duì)Brassicadatabase (BRAD, http://brassicadb.org/brad/index.php)[23]中公布的甘藍(lán)型油菜、白菜(BrassicarapaL.)、甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.)基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得BnGPDH、BrGPDH及BoGPDH蛋白序列，利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析程序核對(duì)確認(rèn)；基于在線網(wǎng)站ExPASY(https://web.expasy.org/compute_pi/)[24]預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子量和等電點(diǎn)。

1.3 BnGPDH的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域分析及染色體定位

運(yùn)用MEGA 7.0軟件[25]的ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)并采用鄰接法(neighbour-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，參數(shù)設(shè)置bootstrap重復(fù)1 000次；在BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得BnGPDH、BrGPDH及BoGPDH的基因組DNA序列、編碼區(qū)(coding sequenc，CDS)序列、內(nèi)含子、外顯子等物理位置信息，用Gene Structure Display Server (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)[26]分析BnGPDH基因結(jié)構(gòu)；利用MEME(http://meme-suite.org/)[27]進(jìn)行BnGPDH蛋白序列的保守元件分析，最大基序檢索值設(shè)置為10，其他設(shè)置采用默認(rèn)；使用Mapchart 2.2軟件[28]對(duì)BnGPDH的染色體位置進(jìn)行展示。

1.4 RNA提取與qRT-PCR分析

采用生工生物工程(上海)股份有限公司EZ-10 DNA away RNA提取試劑盒提取樣品RNA，濃度測(cè)定和質(zhì)量檢測(cè)后用大連寶生物工程有限公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成第一鏈cDNA，并按照SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明在CFX96熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))上進(jìn)行qRT-PCR分析，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 90 s，接著95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸35 s，然后采集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后從 60 ℃升溫到95 ℃進(jìn)行融解曲線分析；運(yùn)用CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[29]；內(nèi)參基因采用BnUBC21(EV086936)；每個(gè)反應(yīng)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)；qRT-PCR所用引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used in qRT-PCR

2 結(jié)果和分析

2.1 GPDH基因的全基因組鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

GPDH基因在甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)和白菜中分別鑒定出18、10和9個(gè)成員。18個(gè)BnGPDH基因中，gDNA長(zhǎng)度從2 058 bp(BnGPDHp1-3)到 3 893 bp(BnGPDHm-4)不等，對(duì)應(yīng)的CDS序列長(zhǎng)度也是從1 071 bp變化到1 896 bp；相對(duì)分子質(zhì)量最低的是BnGPDHp1-1的38.88 ku，最高的為BnGPDHm-2的67.93 ku；等電點(diǎn)從6.08(BnGPDHp1-1)到9.03(BnGPDHm-1)(表2)。

對(duì)甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)和擬南芥4個(gè)物種的GPDH蛋白進(jìn)行序列分析后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，GPDH蛋白被分為3個(gè)亞家族(圖1)：GPDHp亞家族、GPDHc亞家族和GPDHm亞家族。3個(gè)亞家族中均包含6個(gè)BnGPDH和3個(gè)BrGPDH，其中GPDHp亞家族和GPDHc亞家族均有2個(gè)AtGPDH和3個(gè)BoGPDH，而GPDHm亞家族有1個(gè)AtGPDH和4個(gè)BoGPDH。

表2 甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)GPDH基因Table 2 GPDH genes in Brassica napus L., Brassica rapa L., Brassica oleracea L.

圖1 甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)及擬南芥GPDH系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Analysis of phylogenetic tree of B.napus, B.rape, B.oleracea, and Arabidopsis GPDH proteins

2.2 BnGPDH的染色體位置、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

染色體位置分布顯示，18個(gè)BnGPDH分布在A、C基因組的10條染色體上，其中，A01、A03和C01、C03染色體上只分布有1個(gè)BnGPDH基因，A04、A07、C05、C06染色體上均分布有2個(gè)BnGPDH基因，而A05和C04上各分布3個(gè)BnGPDH基因(圖2)。

基因的結(jié)構(gòu)分析表明，BnGPDHp亞家族中的外顯子數(shù)目明顯多于BnGPDHm和BnGPDHc兩個(gè)亞家族，BnGPDHp亞家族中BnGPDHp2-1和BnGPDHp2-2具有8個(gè)外顯子，另外4個(gè)成員外顯子數(shù)目都為10個(gè)，而BnGPDHc亞家族中除了BnGPDHc1-2有6個(gè)外顯子，其余5個(gè)成員都有5個(gè)外顯子，BnGPDHm家族中BnGPDHm-1和BnGPDHm-2具有5個(gè)外顯子，另外4個(gè)成員有6個(gè)外顯子(圖3-A)，同一個(gè)亞家族內(nèi)的基因成員外顯子和內(nèi)含子數(shù)量相對(duì) 一致。

保守結(jié)構(gòu)域分析總共在BnGPDH蛋白中預(yù)測(cè)出20個(gè)保守元件，其中，只有元件2和元件7在所有BnGPDH中都存在，元件6、10、13、15、17只存在于BnGPDHm亞家族成員中；除了BnGPDHc2中的兩個(gè)成員不包含元件20外，BnGPDHc亞家族中的6個(gè)成員都具有元件2、3、4、5、7、8、9、11、12、14、16和20；BnGPDHp亞家族成員具有較少的元件，其中BnGPDHp1中的4個(gè)成員基因都具有相同的元件，即元件1、2、4、7、11、12、14、18、19和20，BnGPDHp2中的兩個(gè)成員只有元件2、7、18與BnGPDHp1成員相同；而BnGPDHm亞家族中的6個(gè)成員都包含16個(gè)同樣的元件(圖3-B)，可見(jiàn)亞家族內(nèi)的成員具有比較一致的元件，而亞家族間的保守元件差異較大。

2.3 BnGPDHc的表達(dá)模式分析

為了明確BnGPDHc組織表達(dá)特征，采用qRT-PCR檢測(cè)了BnGPDHc在高含油量自交系IL130盛花期的根、莖、葉、花、蕾，以及7、14、21、30、40DAF的角果皮和種子中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，BnGPDHc亞家族中的不同成員在不同組織器官中的表達(dá)量各不相同；BnGPDHc1-1、BnGPDHc1-2和BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2在各個(gè)組織器官中均有表達(dá)，且這4個(gè)基因在不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)趨勢(shì)一致：在7DAF中相對(duì)表達(dá)量較高，在14DAF略有下降，到21DAF、30DAF達(dá)到表達(dá)高峰，而40DAF則開始下降；此外，這4個(gè)基因在角果發(fā)育前期(7DAF、14DAF、21DAF)角果皮中的相對(duì)表達(dá)量要略高于后期(30DAF、40DAF)。BnGPDHc1-3和BnGPDHc1-4具有明顯的組織表達(dá)特異性，BnGPDHc1-3在蕾、花中相對(duì)表達(dá)量較高，其次是21DAF、30DAF和40DAF的種子中，而BnGPDHc1-4在30DAF、40DAF的種子和根中的相對(duì)表達(dá)量較高，在其余的組織部位中幾乎不表達(dá)(圖4)?？傮w而言，BnGPDHc的6個(gè)成員在21DAF、30DAF、40DAF的種子中的表達(dá)更為活躍。

圖2 BnGPDH在甘藍(lán)型油菜染色體上的位置Fig.2 Chromosomes location of BnGPDH genes

圖3 BnGPDH基因結(jié)構(gòu)(A)和BnGPDH蛋白保守元件(B)Fig.3 Gene structures of BnGPDH genes (A) and conserved motifs of BnGPDH(B)

Ro.根；St.莖；Le.葉；Bu.蕾；F.花；7dS.7DAF種子；14dS.14DAF種子；21dS.21DAF種子；30dS.30DAF種子；40dS.40DAF種子；7dP.7DAF角果皮；14dP.14DAF角果皮；21dP.21DAF角果皮；30dP.30DAF角果皮；40dP.40DAF角果皮(下同)

Ro.Root；St.Stem；Le.Leaf；Bu.Bud；F.Flower；7dS.Seed of 7DAF；14dS.Seed of 14DAF；21dS.Seed of 21DAF；30dS.Seed of 30DAF；40dS.Seed of 40DAF；7dP.Silique pericarp of 7DAF；14dP.Silique pericarp of 14DAF；21dP.Silique pericarp of 21DAF；30dP.Silique pericarp of 30DAF；40dP.Silique pericarp of 40DAF(the same below)

圖4BnGPDHc在自交系IL130中的組織表達(dá)模式分析
Fig.4 Tissue-specific expression patterns ofBnGPDHcgenes in inbred line IL130

2.4 BnGPDHc在高、低含油量自交系中的差異表達(dá)分析

對(duì)BnGPDHc在3對(duì)高、低含油量自交系的不同組織器官中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：在葉片和21DAF、30DAF、40DAF的角果皮中BnGPDHc的相對(duì)表達(dá)量較低，而在花和蕾中的相對(duì)表達(dá)量較高，但這些組織部位中BnGPDHc的相對(duì)表達(dá)量在高、低含油量材料間差異不顯著；在21DAF的種子中BnGPDHc1-2和BnGPDHc2-1的相對(duì)表達(dá)量在高、低含油量材料間存在顯著差異，30DAF的種子中BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2在高含油量材料中的相對(duì)表達(dá)量要顯著高于低含油量材料，40DAF種子中BnGPDHc的相對(duì)表達(dá)水平在高、低含油量材料間差異不顯著(圖5)。這些結(jié)果說(shuō)明，BnGPDHc1-2、BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2可能與種子TAG的積累相關(guān)。

*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)

* Indicates significant difference atP<0.05;** Indicates significant difference atP<0.01

圖5BnGPDHc在高、低含油量自交系不同組織器官中的差異表達(dá)
Fig.5 Differential expressions ofBnGPDHcgenes between high and low seed oil content inbred lines in different tissues

3 討 論

GPDH在促進(jìn)TAG的合成[5-7]、滲透壓的調(diào)節(jié)[8,10]、防御病原菌侵害[9]等方面具有重要作用，在蓖麻[17]、水稻[18]、玉米[10,19]及甘藍(lán)型油菜[20-21]中已有部分GPDH被克隆和鑒定，但針對(duì)BnGPDH家族的全基因組鑒定尚未見(jiàn)報(bào)道。甘藍(lán)型油菜(AACC，2n=4x=38)是白菜(AA, 2n=2x=20)和甘藍(lán)(CC, 2n=2x=18)2個(gè)二倍體祖先種通過(guò)天然遠(yuǎn)緣雜交形成的異源四倍體作物，理論上擬南芥的單個(gè)基因在白菜和甘藍(lán)基因組上應(yīng)該有3個(gè)拷貝，在甘藍(lán)型油菜基因組上應(yīng)該有6個(gè)拷貝[30]，本研究在甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜和擬南芥中分別鑒定出18、10、9及5個(gè)GPDH基因，白菜和甘藍(lán)進(jìn)化成甘藍(lán)型油菜的過(guò)程中僅有1個(gè)GPDH基因丟失，而擬南芥在進(jìn)化成白菜和甘藍(lán)的過(guò)程中卻出現(xiàn)了更多的GPDH基因丟失，這一現(xiàn)象與高堃等[31]發(fā)現(xiàn)的甘藍(lán)型油菜中PIN1s基因數(shù)量遠(yuǎn)少于甘藍(lán)和白菜中PIN1s基因總數(shù)的現(xiàn)象有所不同，可見(jiàn)不同的基因在進(jìn)化和遺傳上具有一定的差異性。

起源于同一拷貝的基因擁有類似的基因結(jié)構(gòu)和保守元件[32]，例如對(duì)BnCKX家族的分析[33]，本研究基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)同一個(gè)亞家族內(nèi)起源于同一個(gè)擬南芥基因的BnGPDH外顯子和內(nèi)含子數(shù)量相對(duì)一致；保守元件分析發(fā)現(xiàn)BnGPDHm的6個(gè)成員具有完全相同的保守元件，BnGPDHc的6個(gè)成員保守元件也高度相似，暗示BnGPDHm和BnGPDHc這2個(gè)亞家族內(nèi)的基因功能分化較小，但是否存在功能冗余則需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明；BnGPDHm亞家族又分為BnGPDHp1和BnGPDHp2兩個(gè)子集，且這兩個(gè)子集間保守元件存在較大差異，推測(cè)BnGPDHp1和BnGPDHp2可能分別由AtGPDHp1和AtGPDHp2獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)，且存在一定的功能分化。

研究認(rèn)為GPDHm主要與GPDHc協(xié)同作用維持細(xì)胞內(nèi)的G3P動(dòng)態(tài)平衡并參與線粒體的能量代謝過(guò)程[12-13,15]，GPDHp則主要參與質(zhì)體脂類的合成，對(duì)種子含油量影響不大[11,16,20]，而GPDHc在細(xì)胞質(zhì)TAG合成過(guò)程中作用更為關(guān)鍵[6-7]。因此，本研究對(duì)BnGPDHc進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BnGPDHc的6個(gè)成員在21、30、40DAF的種子中的表達(dá)更為活躍，與劉少鋒等[34]的研究結(jié)果一致，油菜種子21DAF-40DAF是油分積累的關(guān)鍵時(shí)期，BnGPDHc的表達(dá)量提高可以促進(jìn)G3P的合成，為TAG的合成提供充足的底物；研究還發(fā)現(xiàn)盡管BnGPDHc在光合器官葉片中的相對(duì)表達(dá)量較低，但BnGPDHc1-1、BnGPDHc1-2、BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2這4個(gè)成員在角果發(fā)育前期的角果皮中的相對(duì)表達(dá)量卻較高，在水稻中的研究也發(fā)現(xiàn)OsGPDH1在生殖發(fā)育時(shí)期的劍葉中的表達(dá)量較高[18]，推測(cè)GPDH可能參與了角果皮、劍葉等光合作用(源)器官的形態(tài)建成；高、低含油量自交系材料不同組織器官qRT-PCR分析顯示21DAF 、30DAF種子中BnGPDHc1-2、BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2的相對(duì)表達(dá)量在高、低含油量自交系中存在不同程度的差異，與Lu等[35]對(duì)高含油品系‘ZS11’和低含油量品系‘WH5557’ 34DAF種子子葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果相吻合，表明這些基因可能在油菜種子TAG合成中具有關(guān)鍵作用，可以作為油菜含油量改良的候選基因研究 利用。

本研究采用生物信息學(xué)分析的方法在甘藍(lán)型油菜基因組中共鑒定出18個(gè)BnGPDH基因，分為BnGPDHp、BnGPDHm和BnGPDHc3個(gè)亞家族，基因結(jié)構(gòu)及保守元件分析顯示亞家族內(nèi)的基因成員具有一定的保守性，亞家族間的成員具有較大差異，暗示亞家族間的基因存在功能分化，qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)BnGPDHc1-2、BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2可能在油菜種子TAG合成中的作用更關(guān)鍵，這些結(jié)果為進(jìn)一步利用這些基因進(jìn)行油菜含油量改良奠定了基礎(chǔ)。