基于線粒體DNA標(biāo)記對(duì)3個(gè)華鳈群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析

朱傳坤 潘正軍 常國亮 吳楠 王輝 丁懷宇 強(qiáng)曉剛 余祥勝

摘要： 華鳈（Sarcocheilichthys sinensis）是一種兼具食用和觀賞價(jià)值的小型鯉科魚類。采用Cytb和D-loop 2個(gè)線粒體DNA序列對(duì)洪澤湖、千島湖和西湖3個(gè)群體的45尾華鳈樣本進(jìn)行了遺傳變異與遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，在長度為404 bp的Cytb序列中，共檢測出變異位點(diǎn)22個(gè)（5.4%），定義了10種單倍型;在998 bp的D-loop序列中，變異位點(diǎn)有40個(gè)（4.0%），構(gòu)成了7種單倍型。2個(gè)標(biāo)記在華鳈群體中的平均單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)分別為0.840±0.033、0.012±0.002、4.759±1.660（Cytb）和0.755±0.036、0.006±0.002、6.430±2.241（D-loop），表現(xiàn)了較高的遺傳多態(tài)性。遺傳多樣性大小順序?yàn)楹闈珊?西湖>千島湖，3個(gè)群體間基因交流較少，表現(xiàn)出極大的遺傳分化，此外，分子變異分析結(jié)果表明華鳈變異的主要來源為群體內(nèi)變異。本研究結(jié)果將為了解我國東部地區(qū)華鳈的遺傳多樣性現(xiàn)狀提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)為華鳈種質(zhì)資源保護(hù)與合理利用提供參考。

關(guān)鍵詞： 華鳈;線粒體DNA;Cytb;D-loop;遺傳多樣性;遺傳分化

中圖分類號(hào)： S917.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）05-0050-07

華鳈（Sarcocheilichthys sinensis Bleeker），俗稱鳈、石鯽、花石鯽、山鯽魚、山鯉子等，隸屬于鯉科（Cyprindae）、[XCZ5.tif;%118%118]亞科（Gobioninae）、鳈屬（Sarcocheilichthys）[1-2]，廣泛分布于我國平原地區(qū)大部分江河、湖泊及其附屬水體中[2]。華鳈不僅可食部分含有率高，肌肉蛋白質(zhì)含量高，且其風(fēng)味氨基酸和不飽和脂肪酸含量豐富，必需氨基酸含量均衡，是一種高蛋白、低脂肪、低能量、味道鮮美的優(yōu)質(zhì)食用魚類[3]。此外，因其色澤鮮亮、體型小、易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，也具有較高的觀賞價(jià)值，深受觀賞魚愛好者喜愛[4-5]。

一直以來，華鳈被視為野雜魚類，并未引起重視，然而隨著大型經(jīng)濟(jì)魚類資源的日漸匱乏，包括華鳈在內(nèi)的小型魚類已成為人們的主要捕撈對(duì)象[6]。近年來，由于捕撈強(qiáng)度增加，水體污染，以及人類活動(dòng)造成的棲息地破壞，華鳈野生資源量銳減[7-8]。目前，人們逐漸認(rèn)識(shí)到了這種小型魚類的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并開展了一系列關(guān)于其人工馴化[8]、繁殖生物學(xué)[9]、人工繁殖[4，10]、生長[5]及胚胎發(fā)育[10]等研究工作。然而，關(guān)于華鳈遺傳學(xué)及基因組學(xué)的研究非常有限[11-13]，而針對(duì)其群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究擬利用Cytb和D-loop 2個(gè)線粒體DNA標(biāo)記對(duì)我國東部地區(qū)3個(gè)華鳈野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以了解該地區(qū)華鳈自然資源遺傳多樣性現(xiàn)狀，并為今后華鳈種質(zhì)資源保護(hù)及優(yōu)良苗種人工繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及DNA抽提

課題組于2015年4月至2017年8月在洪澤湖（江蘇省淮安市淮陰區(qū)韓橋鄉(xiāng)）、千島湖（浙江省杭州市淳安縣富溪鄉(xiāng)）和西湖（浙江省杭州市西湖北里湖）3個(gè)采樣點(diǎn)各采集華鳈樣本15尾。剪取每尾個(gè)體的尾鰭組織后浸泡于無水乙醇中，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法對(duì)各樣本基因組DNA進(jìn)行抽提，DNA質(zhì)量采用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。

1.2 線粒體DNA片段擴(kuò)增與測序

本研究選取了線粒體細(xì)胞色素b基因（Cytb）和控制區(qū)（D-loop）的部分片段作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行分析。2片段的擴(kuò)增引物均參考已發(fā)表的鯉科魚類通用引物，其中Cytb引物序列為F：5′-[JP9]GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′，R：5′-[JP9]CCTCAGAAGGATATTTGTCCTC-3′[14];D-loop引物序列為F：5′-[JP9]CATCTTAGCATCTTCAGTG-3′，R：5′-[JP9]TCACCCCTGGCTCCCAAAGC-3′[15]。

PCR擴(kuò)增體系總體積為50 μL，其中包含10×reaction buffer 5 μL，Taq DNA聚合酶4 U（大連寶生物），dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，上下游引物混合液（2.5 μmol/L）1.6 μL，DNA模板80～200 ng，滅菌超純水36.5 μL。PCR反應(yīng)在BioRad公司的T-100型PCR儀中進(jìn)行，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，運(yùn)行37個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸20 min。PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，利用回收試劑盒Gel Extraction Kit（北京康為世紀(jì)）對(duì)目的片段進(jìn)行回收和純化，純化后的產(chǎn)物送往武漢艾康健生物科技有限公司，利用ABI3730測序平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序所得序列利用Finch TV 1.5軟件進(jìn)行查看及人工矯正，之后將序列保存為fasta格式，并利用Clustal X 1.83軟件[16]進(jìn)行比對(duì)分析。比對(duì)分析完成后將比對(duì)結(jié)果中5′端和3′端參差不齊的序列刪除，使各序列具有相同的長度。后利用DnaSP 4.50.3軟件[17]分析Cytb和D-loop序列中的多態(tài)性核苷酸位點(diǎn)、平均核苷酸差異數(shù)（K）、核苷酸多態(tài)性參數(shù)（π）、單倍型個(gè)數(shù)、單倍型多態(tài)性（Hd）及平均基因流（Nm），此外，利用軟件中的Tajimas D和Fus Fs檢測法進(jìn)行中性檢測。

在Mega 4.0軟件[18]中，利用Kimura 2-parameter遺傳距離構(gòu)建單倍型間的Neighbor-Joining （N-J）進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000，并利用江西鳈（Sarcocheilichthys kiangsiensis）中相應(yīng)同源序列作為外類群，GenBank號(hào)分別為AY952984.1（Cytb）和KY779851.1（D-loop）。為分析群體間的遺傳差異和遺傳距離，利用Arlequin 3.11軟件[19]進(jìn)行分子變異分析（AMOVA）和固定系數(shù)（Fst）計(jì)算。此外，利用IBDWS 3.23軟件（http：//ibdws.sdsu.edu）中的Mantel檢測法對(duì)各群體遺傳距離和地理距離間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置均取默認(rèn)值。

3 討論

3.1 華鳈C(jī)ytb和D-loop堿基組成與變異程度

在魚類群體遺傳研究中，線粒體DNA因具有分子量小、進(jìn)化速度快、母系遺傳和復(fù)制相對(duì)獨(dú)立等優(yōu)點(diǎn)[20]，在多種魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析中得到廣泛應(yīng)用。在線粒體基因組中，不同區(qū)域之間的進(jìn)化速率存在較大差異，一般編碼蛋白質(zhì)的基因序列進(jìn)化較慢，而不編碼蛋白的D-loop區(qū)域，由于所受選擇壓力較小，一般比其他線粒體基因的進(jìn)化速率快2.8～5.0倍[21]，是線粒體基因組中進(jìn)化最快的區(qū)域[22]，因此，D-loop包含了更為豐富的遺傳多樣性信息，在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳分析中普遍應(yīng)用。線粒體DNA上結(jié)構(gòu)和功能解析最為透徹的蛋白質(zhì)編碼基因中的Cytb基因進(jìn)化速度適中，在水產(chǎn)動(dòng)物種群水平差異檢測及種間和種內(nèi)遺傳分化研究中也被廣泛應(yīng)用。在水產(chǎn)動(dòng)物種群遺傳分析研究中，為確保遺傳數(shù)據(jù)的可靠性，研究人員一般會(huì)選擇2個(gè)以上的線粒體DNA片段作為遺傳標(biāo)記，其中利用進(jìn)化速度快的D-loop序列和進(jìn)化速度適中的Cytb序列作為標(biāo)記的研究較多[23-25]。鑒于此，本研究選取D-loop和Cytb序列作為分析華鳈群體遺傳結(jié)構(gòu)的標(biāo)記，以便更加全面地反映華鳈群體遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀。

在動(dòng)物線粒體基因組中，A、T、G、C 4種堿基的分布具有明顯的偏倚性，表現(xiàn)為A、T 2種堿基含量明顯高于G、C含量[26]。本研究獲得的Cytb和D-loop序列中，A+T含量均高于G+C含量，這與多種已報(bào)道魚類中的比例[21，23-24，27]類似。插入、缺失位點(diǎn)在華鳈C(jī)ytb基因序列中未檢測出，而在D-loop序列中共檢測出4個(gè)，這也反映出2個(gè)序列在進(jìn)化過程中承受了不同選擇壓力，Cytb基因由于編碼蛋白質(zhì)，插入、缺失突變極易造成移碼突變而造成蛋白合成障礙，因此，發(fā)生這類突變的個(gè)體往往被淘汰[26];而D-loop序列由于不編碼蛋白，承受的選擇壓力相對(duì)較小，因此，插入、缺失突變?cè)谧匀贿x擇過程相對(duì)較容易保留下來。正因如此，在已報(bào)道魚類中，D-loop序列的多態(tài)位點(diǎn)比例一般均比Cytb序列的高[23-24]，然而，本研究卻得到與之相反的結(jié)果：D-loop序列的多態(tài)位點(diǎn)比例（4.0%）低于Cytb序列中的比例（5.4%），最終導(dǎo)致基于D-loop序列分析所得的單倍型數(shù)（7）、單倍型多樣性（0.755±0.036）和核苷酸多樣性（0.006±0.002）均小于基于Cytb序列所得數(shù)據(jù)（依次為10、0.840±0.033、0.012±0.002）。在另外一種鯉科魚類拉氏[XCZ26.tif;%118%118]（Phoxinus lagowskii）中，也得到了與本研究類似的結(jié)果[27]，可見，雖然總體而言線粒體基因組中D-loop序列的變異程度高于蛋白編碼基因序列，但也存在相反情況，而造成這種變化的原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 華鳈遺傳多樣性與群體遺傳分化

遺傳多樣性與生物的生存能力、適應(yīng)能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)[28]，物種的遺傳多樣性越高，其對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)。而Hd和π是衡量物種或種群線粒體DNA遺傳多樣性程度的2個(gè)重要指標(biāo)，并且有學(xué)者以Hd=0.5和π=0.005為界限，將魚類種群分為分為4種類型：低Hd低π型（Hd<0.5，π<0.005）、高Hd低π型（Hd>0.5，π<0.005）、低Hd高π型（Hd<0.5，π>0.005）和高Hd高π型（Hd>0.5，π>0.005）[29]。本研究中，洪澤湖群體基于2個(gè)線粒體序列的分析結(jié)果均為高Hd高π型;西湖群體基于Cytb時(shí)為高Hd高π型，基于D-loop序列時(shí)為低Hd低π型;千島湖群體基于Cytb時(shí)為高Hd低π型，基于D-loop序列時(shí)為低Hd低π型。以上分析結(jié)果顯示，洪澤湖群體的遺傳多樣性最豐富，而千島湖群體的遺傳多樣性最低，這從Cytb和D-loop序列在3個(gè)群體中的單倍型數(shù)目也可反映出（單倍型數(shù)目：洪澤湖>西湖>千島湖）。雖然千島湖和西湖華鳈群體的遺傳多樣性較低，但就本研究所取華鳈的總體樣本而言，遺傳多樣性參數(shù)仍處于較高水平，這可能是由于不同湖泊的環(huán)境因子對(duì)華鳈種群的影響與選擇壓力不同所致。千島湖和西湖2個(gè)群體基于D-loop序列的核苷酸多樣性指數(shù)均處于低水平，說明棲息環(huán)境破壞、過度捕撈及人類活動(dòng)等因素已影響了這2個(gè)湖泊華鳈種群規(guī)?；謴?fù)，急需加強(qiáng)種質(zhì)資源保護(hù)工作。本研究結(jié)果與楊培民等在拉氏[XCZ26.tif;%118%118]中所得的研究結(jié)果[27]極為類似。

在群體遺傳分化研究中，常用遺傳分化指數(shù)Fst來衡量2個(gè)群體間的分化程度[30]。在表示群體間的遺傳分化程度時(shí)，若Fst介于0～0.05，表示遺傳分化極小;若Fst介于0.05～0.15，表示遺傳分化中等;若Fst介于0.15～0.25，表示遺傳分化較大;若Fst大于0.25，表示遺傳分化極大[31]。本研究中，洪澤湖和千島湖華鳈群體間、千島湖和西湖間均表現(xiàn)為極大的遺傳分化，而洪澤湖與西湖群體間利用Cytb序列的分析結(jié)果為中度分化，而基于D-loop序列時(shí)則為極大分化。此外，盡管千島湖與西湖均位于浙江省，洪澤湖位于江蘇省，但千島湖與西湖華鳈群體間的遺傳分化程度高于與洪澤湖群體間的分化程度，這可能是由于地形與地勢等環(huán)境因素影響了千島湖和西湖華鳈群體間的基因交流，從而表現(xiàn)出的地理距離與遺傳距離間無顯著關(guān)聯(lián)關(guān)系。總體而言，華鳈3個(gè)群體間遺傳分化程度較大，群體間基因交流較少，形成了各自的群體特征，其中較多的群體特異性單倍型就是一個(gè)直觀的反映。盡管如此，A-MOVA分析結(jié)果顯示，華鳈的主要變異來源仍然來自群體內(nèi)部，這與先前報(bào)道的絕大多數(shù)魚類的分析結(jié)果[23-25]相似。利用Cytb和D-loop序列進(jìn)行中性檢驗(yàn)的結(jié)果表明，華鳈未發(fā)生近期的群體擴(kuò)張事件，其群體處于較穩(wěn)定狀態(tài)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張春霖. 中國系統(tǒng)鯉類志[M]. 北京：高等教育出版社，1959：73-74.

[2]伍獻(xiàn)文. 中國鯉科魚類志（下冊(cè)）[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1982：470-471.

[3]李紹明，梁志強(qiáng)，伍遠(yuǎn)安，等. 華鳈肌肉營養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（31）：19233-19235.

[4]宣云峰，王榮泉，徐海華，等. 華鳈人工繁殖試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，2010，31（11）：35-37.

[5]郭 健，鄧其祥，許 明，等. 西河華鳈的年齡和生長研究[J]. 四川師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1995，16（4）：343-346.

[6]林明利，張?zhí)昧?，葉少文，等. 洪澤湖魚類資源現(xiàn)狀、歷史變動(dòng)和漁業(yè)管理策略[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2013，37（6）：1118-1127.

[7]施振寧. 華鳈的馴養(yǎng)與親本培育試驗(yàn)[J]. 江西水產(chǎn)科技，2015（2）：21-23.

[8]宣云峰，王榮泉，徐海華，等. 華鳈馴化養(yǎng)殖試驗(yàn)初探[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚，2010（12）：32.

[9]宋天祥，馬 駿. 華鳈的繁殖生物學(xué)[J]. 動(dòng)物學(xué)研究，1994，15（增刊1）：96-102，199.

[10]宋天祥，馬 駿. 華鳈人工繁殖和早期發(fā)育的研究[J]. 湖泊科學(xué)，1996，8（3）：260-267.

[11]Zhou Z，Zhang H，Wang G，et al. Complete mitochondrial genome of Chinese lake gudgeon Sarcocheilichthys sinensis （Cypriniformes：Cyprinidae）[J]. Mitochondrial DNA，2015，26（1）：141-142.

[12]Li C，He L，Chen C，et al. Sequencing，description and phylogenetic analysis of the mitochondrial genome of Sarcocheilichthys sinensis sinensis （Cypriniformes：Cyprinidae）[J]. Mitochondrial DNA，2016，27（2）：1056-1057.

[13]Yang S，Wei M，Wan Q，et al. The complete mitochondrial genome sequence of Sarcocheilichthys sinensis sinensis （Cypriniformes：Cyprinidae）[J]. Mitochondrial DNA，2014，25（4）：286-287.

[14]Xiao W，Zhang Y，Liu H. Molecular systematics of Xenocyprinae （Teleostei：cyprinidae）：taxonomy，biogeography，and coevolution of a special group restricted in East Asia[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2001，18（2）：163-173.

[15]Liu H Z，Tzeng C S，Teng H Y. Sequence variations in the mitochondrial DNA control region and their implications for the phylogeny of the Cypriniformes[J]. Canadian Journal of Zoology-Revue Canadienne de Zoologie，2002，80（3）：569-581.

[16]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL_X Windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.

[17]Rozas J，Sánchez-Delbarrio J C，Messeguer X，et al. DnaSP，DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[J]. Bioinformatics，2003，19（18）：2496-2497.

[18]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[19]Schneider S，Roessli D，Excoffier L. Arlequin：a software for population genetics data analysis.V3.01.Genetics and Biometry Lab，Department of Anthropology[Z]. 2003.

[20]肖武漢，張亞平. 魚類線粒體DNA的遺傳與進(jìn)化[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2000，24（4）：384-391.

[21]袁 娟，張其中，李 飛，等. 銅魚線粒體控制區(qū)的序列變異和遺傳多樣性[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2010，34（1）：9-19.

[22]郭新紅，劉少軍，劉 巧. 魚類線粒體DNA研究新進(jìn)展[J]. 遺傳學(xué)報(bào)，2004，31（9）：983-1000.[HJ1.91mm]

[23]陳會(huì)娟，劉明典，汪登強(qiáng)，等. 長江中上游4個(gè)鰱群體遺傳多樣性分析[J]. 淡水漁業(yè)，2018，48（1）：20-25，68.

[24]李大命，張彤晴，關(guān)浩勇，等. 基于線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列的高郵湖湖鱭（Coilia nasus）遺傳多樣性分析[J]. 淡水漁業(yè)，2017，47（6）：3-8.

[25]戶 國，程 磊，馬 波，等. 中國達(dá)氏鰉野生群體和兩個(gè)養(yǎng)殖群體的線粒體遺傳多樣性分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2018，25（4）：803-810.

[26]Brown W. Molecular evolutionary genetics[M]. New York：Plenum Press，1985：95-130.

[27]楊培民，胡宗云，金廣海，等. 用線粒體D-loop和Cytb基因序列分析拉氏[XCZ26.tif;%88%88]3個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志，2017，30（4）：7-12，27.

[28]Féral J P. How useful are the genetic markers in attempts to understand and manage Marine biodiversity[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2002，268（2）：121-145.

[29]Grant W S，Bowen B W. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of Marine fishes：Insights from sardines and anchovies and lessons for conservation[J]. Journal of Heredity，1998，89（5）：415-426.

[30]Kirk H，F(xiàn)reeland J R. Applications and implications of neutral versus non-neutral markers in molecular ecology[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011，12（6）：3966-3988.

[31]Balloux F，Lugon-Moulin N. The estimation of population differentiation with microsatellite markers[J]. Molecular Ecology，2002，11（2）：155-165.

收 稿日期：2019-02-14

基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：15KJB240001）;淮陰師范學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：31ZCK00）。

作者簡介：朱傳坤（1984—），男，山東臨沂人，博士，副教授，主要從事魚類基因組學(xué)與分子標(biāo)記輔助育種研究。E-mail：zhuchuankun@hytc.edu.cn。