內(nèi)生木霉P3.9菌株在枇杷根際土壤中的定殖能力測(cè)定

魯海菊 謝欣悅 陶宏征 沈云玫 王棟

摘要： 采用土壤稀釋分離法與平板計(jì)數(shù)法測(cè)定內(nèi)生木霉P3.9菌株在枇杷根際土壤中的種群密度，跟蹤測(cè)試90 d內(nèi)其在枇杷根際土壤中的定殖動(dòng)態(tài)，結(jié)果表明，P3.9菌株在枇杷根際土壤中的定殖過程大致可劃分為3個(gè)階段，前 25 d 內(nèi)，菌株相對(duì)含量以10 d為1個(gè)周期呈增減增減變化趨勢(shì)，且于10 d時(shí)達(dá)到最大值，為9.52×105 CFU/g，該時(shí)期木霉P3.9菌株在根際土壤中快速適應(yīng)并定殖存活;25～65 d期間，P3.9菌株相對(duì)含量的變化周期延長(zhǎng)至20 d，也呈增減增減變化趨勢(shì)，且波動(dòng)幅度較5～25 d期間小，該時(shí)期木霉能夠相對(duì)穩(wěn)定地定殖存活于根際土壤中;65～90 d期間，P3.9 菌株相對(duì)含量在65～75 d期間出現(xiàn)小幅度增加后呈近直線狀下降態(tài)勢(shì);5～75 d期間，P3.9菌株相對(duì)含量維持在105 CFU/g水平上，且75 d時(shí)較接種量只下降1個(gè)數(shù)量級(jí)，說明木霉P3.9菌株在枇杷根際土壤中的持效期可達(dá)75 d。

關(guān)鍵詞： 生防菌;內(nèi)生木霉;定殖能力;根際土壤;枇杷;種群密度法;持效期

中圖分類號(hào)： S436.67+9;S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）05-0263-05

近代以來，隨著化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用，化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全、人體健康等方面的負(fù)面影響越發(fā)引起人們的重視，而有關(guān)生防菌的研發(fā)與應(yīng)用也逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，在所有生防菌制劑中，木霉屬（Trichoderma）真菌制劑產(chǎn)品約占60%[1]。木霉屬真菌在自然界中分布廣泛，是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要組成部分，其菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)對(duì)溫度、濕度、pH值等適應(yīng)范圍廣，且腐生能力強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖速度快，可迅速利用營(yíng)養(yǎng)、占據(jù)空間[2-3]，能防治多種植物的土傳病害。自1932年Weindling發(fā)現(xiàn)木霉以來[4]，人們對(duì)其開展了大量研究，并分離得到多種木霉，而在眾多種類中，綠色木霉、哈茨木霉對(duì)植物病害表現(xiàn)出較好的防治效果[5]。

木霉菌的成功定殖是其發(fā)揮防治作用的基本前提，且防治效果也部分取決于其存活定殖能力[6]。有關(guān)木霉在土壤中定殖能力的研究已有相關(guān)報(bào)道，杜嬋娟等結(jié)合時(shí)間因子，探究了木霉在土壤空間的定殖規(guī)律[7];肖榮鳳等跟蹤分析了對(duì)茄科尖孢鐮刀菌有拮抗作用的哈茨木霉在土壤中的存活與定殖能力[8];古麗君等明確了施用于草坪土壤的木霉在較短時(shí)期內(nèi)的定殖特性[9]。

木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根腐病菌具有極強(qiáng)的抑菌及重寄生作用，抗菌譜廣[10]，且固體發(fā)酵條件簡(jiǎn)單[11]，對(duì)部分化學(xué)農(nóng)藥具有耐藥性[12]，能定殖于枇杷各個(gè)器官及其根際土壤[13]。為進(jìn)一步明確木霉P3.9菌株在枇杷根際土壤中的施用持效期及最佳施用時(shí)期，本研究采用土壤稀釋分離法與平板計(jì)數(shù)法，跟蹤分析該菌株隨時(shí)間延長(zhǎng)在土壤中的定殖動(dòng)態(tài)，以期為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 內(nèi)生木霉（Trichoderma atroviride）P3.9菌株，分離自枇杷主干韌皮部，保存于紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理學(xué)標(biāo)本室。1年生枇杷嫁接苗，種植于直徑為23 cm、深為18 cm的營(yíng)養(yǎng)袋中。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖16 g。木霉選擇性培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g，KCl 0.15 g，K2HPO4 0.9 g，（NH4）2SO4 1.0 g，葡萄糖3.0 g，玫瑰紅[四氯四碘螢素鈉鹽（C20H2O5Cl4I4Na2）]0.033 g，瓊脂粉20 g，75%五氯硝基苯可濕性粉劑0.2 g，蒸餾水 1 000 mL，所用試劑為分析純。配制好的培養(yǎng)基在 121 ℃ 下高壓滅菌 30 min，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木霉菌懸液的準(zhǔn)備與根際土壤接種 將試管斜面保存的P3.9菌株移入PDA平板上活化，待菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，接入新的PDA平板中央進(jìn)行培養(yǎng)，共培養(yǎng)5皿，28 ℃下培養(yǎng)5～7 d;待菌落長(zhǎng)滿全皿，收集所有培養(yǎng)物至粉碎機(jī)中，加入適量無菌水，充分打勻，制成菌懸液，使孢子濃度為1×106 CFU/mL，備用;將孢子懸浮液澆灌于枇杷嫁接苗根際，500 mL/株，以澆灌等量清水作為對(duì)照。重復(fù)10次，常規(guī)肥水管理。

1.2.2 木霉定殖能力的測(cè)定 自澆灌木霉孢子懸浮液起90 d內(nèi)，每隔5 d用高為0.5 m、鉆頭直徑為38 mm的不銹鋼環(huán)刀土鉆在枇杷嫁接苗根際取土樣1次，采集深度為5～15 cm，每處理隨機(jī)取5株，每株采用5點(diǎn)取樣法采集土樣，并采用四分法充分混勻土樣，備用;稱取1 g土樣置于裝有99 mL無菌水的三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為200 r/min的振蕩儀器上振蕩20 min，配制成10-2土壤稀釋懸浮液;靜置2 min后，用無菌微量移液器吸取懸浮液1 mL，加入到 9 mL 無菌水中混勻，即為10-3土壤稀釋懸浮液，如此重復(fù)，依次配制成10-4、10-5土壤稀釋懸浮液;取10-5土壤稀釋懸浮液50 μL，采用傾注法加入木霉選擇性平板培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3～5 d，統(tǒng)計(jì)平板上直徑≥10 mm、近圓形、扁平、呈放射狀的無色透明或淺綠色單菌落數(shù)量，重復(fù)5次;計(jì)算土樣中木霉種群密度，計(jì)算公式為

種群密度=每皿菌落平均值×稀釋倍數(shù)×20×水分系數(shù);

環(huán)比增長(zhǎng)率=（本期的木霉種群密度-上一期木霉種群密度）/上一期木霉種群密度×100%;

同比增長(zhǎng)率=（本階段木霉種群密度變化值-上一相同變化階段木霉種群密度變化值）/上一相同變化階段木霉種群密度變化值×100%。

其中，環(huán)比增長(zhǎng)率、同比增長(zhǎng)率為正值時(shí)表示增長(zhǎng)，為負(fù)值時(shí)表示下降。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總計(jì)算、作圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤5～90 d期間的定殖動(dòng)態(tài)

由圖1可見，P3.9菌株在枇杷根際土壤中的定殖過程大致可劃分為3個(gè)階段，第1階段為前25 d內(nèi)，菌株相對(duì)含量以10 d為1周期呈“增減增減”變化趨勢(shì)，且于10 d時(shí)達(dá)到最大值，為9.52×105 CFU/g，該時(shí)期木霉P3.9菌株在根際土壤中快速適應(yīng)并定殖存活;第2階段為25～65 d期間，P3.9菌株相對(duì)含量的變化周期延長(zhǎng)至20 d，也呈“增減增減”變化趨勢(shì)，且波動(dòng)幅度較5～25 d期間小，該時(shí)期木霉能夠相對(duì)穩(wěn)定地定殖存活于根際土壤中;第3階段為65～90 d期間，P3.9菌株相對(duì)含量在施入土壤65～75 d期間出現(xiàn)小幅度增加后呈近直線狀下降態(tài)勢(shì)，75 d時(shí)木霉相對(duì)含量為1.11×105 CFU/g，較接入的初始木霉數(shù)量下降1個(gè)數(shù)量級(jí)，而至90 d時(shí)木霉相對(duì)數(shù)量達(dá)到最低值，為4×103 CFU/g。

2.2 木霉P3.9菌株施入枇杷根際土壤3個(gè)階段的定殖動(dòng)態(tài)分析

2.2.1 第1階段 由表1、圖2、圖3可見，在5～25 d 期間，枇杷根際土壤施入木霉P3.9菌株的處理，木霉相對(duì)含量（孢子數(shù)量）以10 d為1周期呈“增減增減”波動(dòng)變化，且總體減少趨勢(shì)，木霉施入土壤后前期相對(duì)含量迅速上升，10 d時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)木霉相對(duì)含量為9.52×105 CFU/g，較接種5 d時(shí)環(huán)比增長(zhǎng)575.18%，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，接種處理 15 d 時(shí)木霉相對(duì)含量較10 d時(shí)環(huán)比下降70.27%，之后又上升，接種處理20 d時(shí)菌體相對(duì)含量較15 d時(shí)環(huán)比上升116.96%，之后又下降，接種25 d時(shí)較接種20 d時(shí)環(huán)比下降76.71%;接種處理5～25 d內(nèi)，每隔5 d測(cè)得的木霉相對(duì)含量相互間差異極顯著（P<0.01），且10～25 d測(cè)得的木霉相對(duì)含量均高于最初檢測(cè)值，表明該測(cè)試菌株施入土壤后前期定殖能力較強(qiáng);木霉在枇杷根際土壤中的定殖共歷經(jīng)2個(gè)周期（5～15 d、15～25 d），第2個(gè)周期的波動(dòng)幅度低于第1個(gè)周期， 第2個(gè)周期增長(zhǎng)階段較第1個(gè)周期增長(zhǎng)階段同比下降59.19%。未接種的對(duì)照組沒有觀察到木霉菌落的出現(xiàn)。

2.2.2 第2階段 由表2、圖4、圖5可見，在25～65 d期間，每隔5 d測(cè)得的土壤中木霉相對(duì)含量相互間存在極顯著差異（P<0.01）;未接種木霉的對(duì)照組分別于30、50、60 d觀察到極少量木霉，其他調(diào)查時(shí)間未觀察到木霉菌落的出現(xiàn)。該階段，木霉相對(duì)含量變化同樣歷經(jīng)2個(gè)周期（25～45 d、45～65 d），時(shí)間間隔延長(zhǎng)為20 d，木霉相對(duì)含量分別于25～35 d、45～55 d呈上升趨勢(shì)，35～45 d、55～65 d呈下降態(tài)勢(shì)，在第1個(gè)周期內(nèi)，接種處理 35 d 時(shí)的菌體相對(duì)含量較25 d時(shí)環(huán)比上升 93.01%，45 d時(shí)的菌體相對(duì)含量較35 d時(shí)環(huán)比下降67.03%;在第2個(gè)周期內(nèi)，接種處理55 d時(shí)的菌體相對(duì)含量較 45 d 時(shí)環(huán)比上升205.49%，65 d時(shí)的菌體相對(duì)含量較55 d時(shí)環(huán)比下降67.27%;第2個(gè)周期增長(zhǎng)階段較第1個(gè)周期增長(zhǎng)階段同比上升40.60%，而下降階段同比上升1.08%，2個(gè)周期的波動(dòng)幅度相似且最值接近，說明該階段測(cè)試菌株定殖存活能力的動(dòng)態(tài)變化趨于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.3 第3階段 由表3、圖6可見，在65～90 d期間，隨調(diào)查時(shí)間的延長(zhǎng)，接種處理的木霉相對(duì)含量呈先增后減的變化趨勢(shì)，沒有明顯的周期性變化規(guī)律，且菌株的定殖存活能力已處于整體測(cè)試階段的最低水平，而未接種木霉的對(duì)照組分別于70、75 d時(shí)觀測(cè)到有少量木霉出現(xiàn)，而其他調(diào)查時(shí)間均未發(fā)現(xiàn);接種處理70 d時(shí)的木霉相對(duì)含量達(dá)到本階段最大值，為1.45×105 CFU/g，較65 d時(shí)環(huán)比上升59.34%，而75 d時(shí)的木霉相對(duì)含量較 70 d 時(shí)環(huán)比下降23.45%;接種處理75 d后菌體相對(duì)含量呈近直線下降趨勢(shì)，90 d時(shí)達(dá)到最低值，僅為4.00×103 CFU/g，此時(shí)若無外力干預(yù)，該菌株在施用土壤中可能無法繼續(xù)存活并發(fā)揮生防作用。

3 結(jié)論與討論

有研究表明，生防菌的快速定殖能力是提高其對(duì)土傳病害防治效果的重要因素之一[14]。許傳坤等研究表明，木霉的萌發(fā)會(huì)受到土壤抑真菌作用的抑制[15]。賀字典等研究發(fā)現(xiàn)，某些木霉在施入土壤后會(huì)歷經(jīng)一個(gè)適應(yīng)過程，一旦適應(yīng)后其定殖數(shù)量會(huì)迅速上升[16]?？灯贾サ劝l(fā)現(xiàn)，在施入土壤的較短時(shí)期內(nèi)，木霉數(shù)量會(huì)迅速到達(dá)峰值，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸呈下降趨勢(shì)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，木霉P3.9菌株在施入土壤的最初10 d內(nèi)，相對(duì)含量呈指數(shù)形增長(zhǎng)，接種10 d時(shí)達(dá)到最大值，隨后開始回落，并以 10 d 為1個(gè)周期呈“增減增減”變化趨勢(shì)，且增減幅度相對(duì)較大，而自接種處理25 d開始，呈以20 d為周期的“增減增減”變化趨勢(shì)，增減幅度減小，說明木霉P3.9菌株在歷經(jīng)較短適應(yīng)期后快速定殖于施用土壤中。

古麗君等研究發(fā)現(xiàn)，深綠木霉接種于土壤后，前期存在大量孢子，隨著調(diào)查時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子數(shù)量呈先逐漸下降、再略有上升、后保持相對(duì)穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，穩(wěn)定時(shí)木霉在土壤中的相對(duì)含量為 104 CFU/g[9]。徐瑞富等研究發(fā)現(xiàn)，木霉在未滅菌耕作層、亞表層中的定殖變化趨勢(shì)呈先增后減、波浪狀生長(zhǎng)曲線[18]。Orr等研究表明，將1株木霉菌株存放在持續(xù)保濕的環(huán)境中，3 d后菌落數(shù)量變化與時(shí)間的增加呈正相關(guān)關(guān)系，保存時(shí)間延長(zhǎng)到5 d后，隨保存環(huán)境的改變，菌株含量呈下降趨勢(shì)[19]。本研究結(jié)果表明，內(nèi)生木霉P3.9菌株接種處理75 d時(shí)的相對(duì)含量雖較接入時(shí)的初始菌量下降近1個(gè)數(shù)量級(jí)，但土壤中該菌體相對(duì)含量仍能穩(wěn)定在 105 CFU/g，說明木霉P3.9菌株相對(duì)含量相對(duì)穩(wěn)定，持續(xù)期約為75 d，優(yōu)于古麗君等研究報(bào)道的菌株[9，20]，這可為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

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收 稿日期：2019-02-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31660147）;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：2016FB066）;紅河學(xué)院應(yīng)用型科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：XJY15Z06）。

作者簡(jiǎn)介：魯海菊（1978—），女，云南大理人，博士，教授，從事植物病理學(xué)研究。E-mail：luhaiju2011@126.com。