慢病毒介導(dǎo)長鏈非編碼RNA H19過表達對非酒精性脂肪性肝病大鼠的影響

姜 明 金 晶 沈紅波 王 金 鄭 杰 周一農(nóng)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是患者無過量飲酒史而肝細胞出現(xiàn)炎性反應(yīng)、壞死或凋亡的一系列肝臟疾病[1-2]。NAFLD發(fā)生、發(fā)展的機制尚未明確，其對疾病的治療具有重要意義[3]。Rabelo等[4]的研究表明，氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶4((NOX4)與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。研究顯示長鏈非編碼RNA H19(lncRNA H19)過表達對肝功能及肝損傷具有保護作用[5]。然而，lncRNA H19是否可通過調(diào)節(jié)NOX4的表達改變NAFLD大鼠肝組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)尚未可知。本研究探討了lncRNA H19過表達對NAFLD大鼠肝損傷修復(fù)、脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)以及肝功能改善的影響，并探究了lncRNA H19是否可通過調(diào)控NOX4來抑制大鼠NAFLD的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體(SPF)級SD大鼠50只，雄性，(170±20)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號SCXK(京)2018-0042。保持室溫(22±3)℃，相對濕度(50±20)%，明暗交替各12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。自由飲水、進食。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：膽酸鈉(安徽科寶生物公司)，蛋黃粉(北京奧博星生物公司)，食用豬油(浙江金恩食品有限公司)，膽固醇(上海醫(yī)藥公司)，基礎(chǔ)飼料(北京奧博星生物技術(shù)公司)，水合氯醛(天津福星公司)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)ELISA試劑盒、三酰甘油(TG)ELISA試劑盒、總膽固醇(TC)ELISA試劑盒(上海碧云天公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、BCA蛋白定量測定試劑盒(上海碧云天公司)，RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Beyotime公司)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶公司)、兔多克隆抗NOX4抗體(美國Abcam公司)，HRP標記山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物公司)，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(上海碧云天公司)，ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)。

儀器：超聲破碎儀(上海歐河公司)，垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增儀(美國Bio-Rad公司)。由沈陽萬類公司設(shè)計PCR引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

注：TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長因子-β1，CTGF為結(jié)締組織生長因子

1.3 動物模型制備與分組

參考文獻進行大鼠NAFLD模型制備[6]。將50只大鼠隨機分為對照組10只、高脂飼料組40只。對照組給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)8周，高脂飼料組給予高脂飼料(70.5%基礎(chǔ)飼料、20%食用豬油、7%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉豬油)飼養(yǎng)8周。從高脂飼料組40只大鼠中隨機處死10只，取出肝臟制作病理切片，觀察肝臟病理改變以判斷是否造模成功。將造模成功的30只大鼠隨機分為模型組、空載體組、過表達H19組；對照組大鼠繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)4周，模型組、空載體組、過表達H19組大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)4周，其中空載體組大鼠在第9、10、11周第1天于尾靜脈注射空載體200 μL，過表達H19組大鼠在相同時間點于尾靜脈注射lncRNA H19慢病毒載體200 μL，4組大鼠在實驗12周后全部處死。每只大鼠予測體質(zhì)量并計算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)=肝臟濕重/大鼠體質(zhì)量×100%)。

1.4 ELISA法及生物化學(xué)法檢測各組肝功能、血脂及氧化應(yīng)激指標

實驗第12周末，大鼠禁食12 h后測體質(zhì)量。給予各組大鼠腹腔注射1 mL/kg戊巴比妥鈉麻醉，剪開腹腔，于心臟取血5 mL，3 000 r/min，離心15 min。取上清，置于-20 ℃冰箱待用。將血清從冰箱中取出，用適量Assay Buffer稀釋。用ELISA試劑盒檢測各組血清ALT、AST、TC、TG水平。用生物化學(xué)試劑盒測定氧化應(yīng)激指標。

1.5 HE染色觀察各組肝組織病理變化

大鼠麻醉方法同上。剪開腹腔，用0.9%氯化鈉溶液進行心臟灌流，排空大鼠體內(nèi)血液，迅速取出肝組織，并從肝右小葉取黃豆大小的組織塊，放入4 %多聚甲醛中固定24 h，再用乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。組織切片經(jīng)脫蠟，水化，HE染色，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。

1.6 RT-PCR法檢測各組肝組織中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA表達水平

肝組織的采集方法同上，取出肝臟進行總RNA提取，使用Trizol法對研磨后的組織抽提RNA，利用紫外分光光度儀檢測純度。cDNA反轉(zhuǎn)錄合成階段，取1 μg RNA，加入反應(yīng)試劑，以終體積20 μL的體系進行cDNA合成，65 ℃ 15 min，43 ℃ 20 min，70 ℃ 15 min。RT-PCR擴增階段，采用Bio-Rad PCR儀進行，94 ℃ 15 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的RNA的相對表達量，內(nèi)參是β-actin。

1.7 Western Blotting法檢測各組肝組織中NOX4蛋白表達水平

裂解液裂解肝組織，低溫離心30 min以提取總蛋白，BCA法計算樣本總蛋白水平，加入適量上樣緩沖液，沸水浴7 min使蛋白充分變性，電泳，完畢后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。兔多克隆抗NOX4抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜，HRP標記山羊抗兔IgG(1∶1 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液避光顯色。利用Image-pro plus 5.0軟件進行條帶掃描半定量，NOX4蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組的體質(zhì)量、肝臟濕重與肝臟指數(shù)比較

模型組、空載體組、過表達H19組的體質(zhì)量、肝臟濕重及肝臟指數(shù)均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。空載體組與模型組的體質(zhì)量、肝臟濕重及肝臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組、空載體組相比，過表達H19組的體質(zhì)量、肝臟濕重及肝臟指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組的體質(zhì)量、肝臟濕重及肝臟指數(shù)比較()

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與空載體組比較，cP<0.05

2.2 各組的血清ALT、AST、TC、TG水平比較

模型組、空載體組、過表達H19組的血清ALT、AST、TC、TG水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)?？蛰d體組與模型組的血清ALT、AST、TC、TG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組、空載體組相比，過表達H19組的血清ALT、AST、TC、TG水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與空載體組比較，cP<0.05

圖1各組血清ALT、AST、TC、TG水平比較AALTBASTCTCDTG

2.3 各組的肝臟病理學(xué)評估

光學(xué)顯微鏡下，對照組的肝小葉結(jié)構(gòu)保持完整，肝索放射性分布，界板完整，中央靜脈清晰可見，肝細胞幾乎無脂肪變性，小葉內(nèi)幾乎無炎性反應(yīng)，肝細胞也無氣球樣病變。模型組、空載體組的肝組織中脂滴增多，大泡形和小泡形均存在，明顯可見氣球樣變，門管區(qū)出現(xiàn)炎性細胞，腺泡內(nèi)可見點狀肝細胞壞死，并有約50%的大鼠出現(xiàn)肝細胞纖維化。過表達H19組的肝細胞病變明顯減少，可見小葉內(nèi)部分匯管區(qū)炎性反應(yīng)，點狀肝細胞壞死，無氣球樣病變。見圖2。

圖2 各組的肝臟病理改變 HE染色 ×200 A 對照組 B 模型組 C 空載體組 D 過表達H19組

2.4 各組大鼠肝組織中SOD、GSH、MDA的水平比較

與對照組相比，模型組、空載體組的肝組織中SOD、GSH水平降低、MDA水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？蛰d體組與模型組的肝組織中SOD、GSH、MDA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組、空載體組相比，過表達H19組的肝組織中SOD、GSH水平升高、MDA水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組的肝組織中SOD、GSH和MDA水平比較()

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與空載體組比較，cP<0.05

2.5 各組的肝組織中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA表達水平比較

與對照組相比，模型組、空載體組的肝組織中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？蛰d體組與模型組的肝組織中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組、空載體組相比，過表達H19組肝組織中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肝組織中NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA及CTGF mRNA的表達水平比較()

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與空載體組比較，cP<0.05

2.6 各組的肝組織中NOX4蛋白的表達水平比較

對照組、模型組、空載體組、過表達H19組的肝組織中NOX4蛋白相對表達量分別為(0.09±0.09)%、(0.33±0.12)%、(0.28±0.11)%、(0.15±0.09)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.64，P<0.001)。與對照組比較，模型組、空載體組大鼠肝組織中NOX4蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？蛰d體組與模型組的肝組織中NOX4蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。過表達H19組的肝組織中NOX4蛋白表達水平低于模型組、空載體組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組肝組織中NOX4蛋白的表達水平比較

3 討論

NAFLD主要是由TG在肝臟內(nèi)過度貯積而引起的疾病。目前認為NAFLD的發(fā)生、發(fā)展與多種因素相關(guān)，如氧化應(yīng)激、肥胖、糖尿病、脂質(zhì)代謝異常、胰島素抵抗以及低度炎性反應(yīng)等[7]。肝臟是對氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷非常敏感的器官，氧化應(yīng)激是NAFLD中肝纖維化的關(guān)鍵因素[8]。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧簇(ROS)不但可損傷肝細胞，還可通過激活氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化通路進一步加重肝細胞損傷,從而引發(fā)肝臟炎性反應(yīng)甚至肝硬化、肝細胞癌[9]。

人體存在很多抗氧化系統(tǒng)，如GSH、SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD大鼠模型中，抗氧化物SOD、CATSP 均顯著下降，表現(xiàn)為氧化應(yīng)激狀態(tài)，并可通過抑制NOX4蛋白的表達進行調(diào)控，抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[14]。研究發(fā)現(xiàn)，NOX4的表達受到lncRNA H19的抑制，過表達的lncRNA H19通過對NOX4的抑制而延緩了肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[15]。本實驗建立了NAFLD大鼠模型，從各組大鼠的體質(zhì)量、肝臟濕重、肝臟指數(shù)、病理以及血清ALT、AST、TC、TG可見，與對照組相比，模型組、空載體組、過表達H19組均有不同程度的肝臟病變。而與模型組、空載體組相比，過表達H19組的上述指標均有不同程度的預(yù)后改善，提示過表達lncRNA H19可能對高脂飲食所致的NAFLD大鼠的肝損傷有一定的保護作用。本實驗還檢測了各組大鼠肝組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標SOD、GSH、MDA水平以及NOX4 mRNA、TGF-β1 mRNA、CTGF mRNA的表達水平，結(jié)果顯示與對照組相比，模型組、空載體組、過表達H19組的上述指標均有不同程度的改變，而與模型組、空載體組相比，過表達H19組的上述氧化應(yīng)激指標則有明顯改善。本研究進一步驗證了NOX4蛋白的表達情況，也得到了同樣的結(jié)果。這些結(jié)果提示，NAFLD大鼠的肝損傷伴隨著氧化應(yīng)激的改變，并且氧化應(yīng)激可能對NAFLD大鼠的肝損傷有至關(guān)重要的促進作用；過表達lncRNA H19可能抑制了NOX4的表達，進而抑制了NOX4對氧化應(yīng)激的激活作用，從而起到對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝損傷的保護作用。今后將進一步驗證過表達lncRNA H19對其他參與NAFLD發(fā)生、發(fā)展的信號通路的作用，以彌補本研究的局限。

綜上所述，過表達lncRNA H19可通過抑制NOX4的表達抵抗氧化應(yīng)激的激活，進而對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠的肝損傷起保護作用。lncRNA H19可能是NAFLD的新靶點，今后有待對其機制進行深入探討。