CTGF mRNA在潰瘍性結(jié)腸炎組織中的表達及與病情和預后的關(guān)系

蔣麗琳 肖南平 楊興平 郭 娟 蔣 歡 孫傳喜

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性非特異性炎性疾病，以緩解和復發(fā)交替為主要特征，嚴重影響患者的正常生活[1-2]。目前針對UC的治療方式主要有藥物治療和外科干預，雖能在一定程度上控制炎性反應，但易復發(fā)[3]。因此，干預UC患者炎性反應的發(fā)生、發(fā)展是治療的關(guān)鍵，但目前UC的發(fā)病機制尚未闡明，且缺乏有效的生物學標志物用以評估UC患者的炎性反應程度及預后。近年來多項研究報道，信使RNA(mRNA)在UC患者的腸道組織、血液中異常表達，參與UC的病理生理過程[4-7]。有研究表明，結(jié)締組織生長因子(CTGF) mRNA可介導細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路，從而調(diào)控UC的炎性因子水平及腸道菌群[8]，但目前關(guān)于CTGF mRNA與UC患者病情及預后關(guān)系的報道較少。本研究選取83例UC患者作為研究對象，檢測其UC組織中CTGF mRNA的相對表達量，并分析其與患者病情及預后的關(guān)系，以期為UC的治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年2月至2017年4月在廣元市第一人民醫(yī)院就診的83例UC患者作為研究對象。根據(jù)《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[9]對疑似UC患者進行診斷，并最終經(jīng)組織病理學檢查確診為UC。納入標準：(1)年齡18～70歲；(2)結(jié)腸鏡檢查至回盲部；(3)首次就診；(4)就診前未服用抗炎藥物。排除標準：(1)合并急性感染性腸炎；(2)合并惡性腫瘤；(3)合并其他自身免疫性疾?。?4)合并心、肝及腎等臟器功能障礙。另擇同期經(jīng)結(jié)腸鏡檢查并切除結(jié)腸息肉的85例患者作為對照組。UC組中男性54例，女性29例，平均年齡(47.66±9.22)歲；對照組中男性48例，女性37例，平均年齡(49.23±8.52)歲。兩組患者在性別(χ2=1.299，P=0.254)、年齡(t=1.147，P=0.253)方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究中所有患者均簽署了知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有患者的年齡、性別、結(jié)腸鏡表現(xiàn)及病變位置等資料。病變位置根據(jù)蒙特利爾分型進行劃分，E1為病變部位局限于直腸，未達到乙狀結(jié)腸；E2為病變累及左半結(jié)腸，遠離脾曲；E3為廣泛病變累及脾曲乃至全結(jié)腸。

1.2.2 UCEIS評分及內(nèi)鏡下活動度 根據(jù)受累腸段最嚴重處的血管紋理(0～2分)、出血情況(0～3分)、糜爛和潰瘍(0～3分)這3個方面計算UCEIS評分。血管紋理正常計0分，斑片狀計1分，完全閉塞計2分。黏膜及腸腔無出血計0分，黏膜出血計1分，輕度計2分，中重度計3分。無糜爛及潰瘍計0分，糜爛計1分，淺表性糜爛和潰瘍計2分，深部糜爛和潰瘍計3分。UCEIS評分為以上3項評分之和，其中內(nèi)鏡下輕、中度活動度為2～6分，內(nèi)鏡下重度活動度為7或8分[10]。

1.2.3 RT-qPCR法檢測結(jié)腸組織中CTGF mRNA相對表達量 無菌環(huán)境下用剪刀將結(jié)腸組織剪碎，置于液氮中用研缽研磨。取研磨液置于試管中，4 000 r/min離心15 min，提取上清液。將上清液加入總RNA提取試劑盒(日本TOYOBO公司)中提取總RNA。取2 μg總RNA加入反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO公司)中進行反轉(zhuǎn)錄反應，然后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入PCR擴增儀中進行擴增，擴增條件為94 ℃ 10 min預變性，然后94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。內(nèi)參為GAPDH，ΔCt=CtCTGF mRNA-CtGAPDH，用 2-ΔΔCt表示CTGF mRNA的相對表達量。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 預后隨訪 根據(jù)《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[9]對UC患者進行標準化治療。83例UC患者出院后進行為期2年的電話隨訪，每月隨訪1次，隨訪截止時間為2019年4月30日。若UC患者治療后未復發(fā)則視為預后良好，若治療后復發(fā)、并發(fā)中毒性巨結(jié)腸、惡變或結(jié)腸大出血則視為預后不良[11]。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組結(jié)腸組織中CTGF mRNA相對表達量的比較

UC組患者結(jié)腸組織中CTGF mRNA的相對表達量為1.87±0.19，顯著高于對照組(0.46±0.11)，差異有統(tǒng)計學意義(t=58.978，P<0.001)。

2.2 CTGF mRNA與UC嚴重程度的關(guān)系

83例UC患者的UCEIS評分為(4.71±1.81)分，其中內(nèi)鏡下輕、中度活動度患者66例(79.52%)，內(nèi)鏡下重度活動度患者17例(20.48%)。重度活動度UC患者結(jié)腸組織中CTGF mRNA的相對表達量為2.07±0.16，高于輕、中度活動度UC患者(1.82±0.16)，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.831，P<0.001)。UC患者結(jié)腸組織中CTGF mRNA的相對表達量與UCEIS評分呈正相關(guān)(r=0.798，P<0.001)，詳見圖1。

圖1 UC患者CTGF mRNA的相對表達量與UCEIS評分的散點圖

2.3 CTGF mRNA評價UC患者預后的價值

83例UC患者中50例(60.24%)預后良好，33例(39.76%)預后不良，其中29例(34.94%)復發(fā)，1例(1.20%)并發(fā)中毒性巨結(jié)腸，2例(2.41%)癌變，1例(1.20%)結(jié)腸大出血。CTGF mRNA診斷UC患者預后不良的ROC曲線下面積(AUC)為0.925(95%CI：0.844～0.970)，最大約登指數(shù)為0.699，cut-off值為1.86，敏感度為93.94%，特異度為76.00%，詳見圖2。

圖2 CTGF mRNA診斷UC患者預后的ROC曲線

2.4 影響UC患者預后的相關(guān)因素分析

兩組患者在年齡、性別和病變位置方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。預后不良組UCEIS評分>6分和CTGF mRNA相對表達量>1.86占比均高于預后良好組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，詳見表2。進一步將UCEIS評分和CTGF mRNA相對表達量作為自變量，將UC患者預后作為因變量，分析顯示UCEIS評分和CTGF mRNA相對表達量均與UC患者預后密切相關(guān)(P均<0.05)，詳見表3。

表2 影響UC患者預后的單因素分析/例(%)

表3 影響UC患者預后的多因素Logistic回歸分析

3 討論

腸上皮細胞是機體腸道的物理屏障，腸上皮細胞的緊密連接及功能穩(wěn)定是對抗外界細菌的可靠屏障[12]。當腸上皮細胞功能調(diào)節(jié)失衡，機體腸道會發(fā)生炎性反應，同時細胞內(nèi)mRNA的表達將有所改變[13-15]。本研究結(jié)果顯示，UC組CTGF mRNA的相對表達量高于對照組，提示CTGF mRNA可能參與了UC的發(fā)病及進展過程。本研究結(jié)果還顯示，重度活動度UC患者的CTGF mRNA相對表達量高于輕、中度活動度UC患者，且UC患者結(jié)腸組織中的CTGF mRNA相對表達量與UCEIS評分呈正相關(guān)，上述結(jié)果表明CTGF mRNA相對表達量隨UC病情加重而升高，進一步證實了CTGF mRNA參與了UC的發(fā)病及進展。梁美蘭等[16]的研究結(jié)果表明，腸上皮細胞損傷及炎性細胞浸潤可促進纖維細胞活化、增殖并合成腸壁細胞外基質(zhì)(ECM)，在上述過程中CTGF可促進纖維細胞活化及ECM沉積，佐證了本研究結(jié)果，即隨著UC活動度增加，CTGF mRNA相對表達量升高。本研究ROC曲線分析顯示AUC為0.925，表明CTGF mRNA對UC預后評價的價值較高，可輔助評價UC預后。有報道指出CTGF mRNA在腸上皮黏膜細胞炎性損傷進展為纖維化階段的過程中發(fā)揮著重要作用[16]，推測結(jié)腸組織中CTGF mRNA的相對表達量可反映UC的預后情況。本研究的多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，UCEIS評分和CTGF mRNA相對表達量均與UC患者的預后密切相關(guān)。

CTGF是即刻早期基因CCN家族的一員，具有多種調(diào)節(jié)功能，尤其在肺纖維化中發(fā)揮了重要作用[17]。CTGF mRNA在特發(fā)性肺纖維化患者的肺泡灌洗液及肺組織中高表達，且可反映肺的纖維化程度[18-19]；此外，還有基礎(chǔ)研究證實轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)可促使肺成纖維細胞中CTGF表達水平升高，而用小分子RNA干擾CTGF后，可有效抑制肺成纖維細胞的增殖、轉(zhuǎn)化及ECM合成等[20-21]。基于上述研究結(jié)果，推測CTGF與UC患者結(jié)腸損傷部位的纖維化有關(guān)。正常情況下，結(jié)腸組織中幾乎無CTGF表達，但當機體結(jié)腸黏膜損傷時，釋放大量炎性因子，同時炎性細胞浸潤，機體組織調(diào)節(jié)TGF-β1/CTGF信號轉(zhuǎn)導通路，進而促使損傷部位纖維化。目前已有多個體內(nèi)及體外模型表明CTGF是TGF-β1的下游調(diào)節(jié)因子，可反映組織重塑及纖維化程度[22]。CTGF高表達可刺激間質(zhì)細胞活化，并誘導其產(chǎn)生更多的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原等，進而介導以纖連蛋白為主的ECM沉積，促進間質(zhì)細胞黏附Ⅰ型膠原，導致腸纖維化發(fā)生。有研究表明，CTGF表達與腸黏膜炎性反應程度有關(guān)，CTGF與腸上皮細胞損傷、修復及炎性因子釋放密切相關(guān)[16]。推測CTGF mRNA可能通過調(diào)節(jié)UC組織中炎性因子水平而控制結(jié)腸炎性反應，同時影響腸道菌群，使腸道免疫失衡，促進UC病情進展，進而影響患者預后。

綜上所述，CTGF mRNA在UC組織中高表達，且與UC患者病情進展有關(guān)。檢測UC患者結(jié)腸組織中CTGF mRNA的相對表達量有助于評估UC患者的病情及預后。本研究尚存在不足之處：本研究為單中心研究，樣本量偏??；在分析影響UC患者預后的相關(guān)因素時納入研究的因素較少。后續(xù)將進行多中心研究，擴大樣本量，同時收集更多關(guān)于UC發(fā)病及進展的相關(guān)因素，以驗證并補充本研究結(jié)論。