張文文，任英，張榮超，郝貴周

(魯南貝特制藥有限公司，中藥制劑新技術研究中心，山東 臨沂 271600)

金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花。具有清熱解毒，疏散風熱之功效，臨床應用廣泛，年需求量一般在萬噸以上?；瘜W成分多樣[1-6]，藥理作用廣泛[7]；現(xiàn)已從金銀花中分離出的化合物有145種，主要為有機酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類化合物等[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證明,金銀花藥理作用主要表現(xiàn)在抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫調節(jié)等方面。忍冬葉作為新藥源，年產量一般在數(shù)十萬噸以上。與金銀花相比，化學成分相似、臨床功效基本相同。李時珍《本草綱目》曾記載“莖葉及花，功用皆同”，并且忍冬葉不受花期限制，四季均可采收。但各產區(qū)忍冬葉仍作為非藥用部位被丟棄，造成了極大的資源浪費和經濟損失。目前，國內外對忍冬葉進行了一定相關研究，但與金銀花相比，其研究還不夠深入，未能充分挖掘其藥理功效及藥效物質基礎。因此，本文在傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾基礎上，采用水-有機溶劑多級蒸餾提取金銀花及忍冬葉揮發(fā)油，進行成分對比分析，同時進行揮發(fā)油提取物的增強免疫作用研究，探討金銀花和忍冬葉揮發(fā)油對增強小鼠淋巴細胞增殖效果的影響。

1 儀器和試藥

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(Agilent 6890/5973型)和 GC-MSD數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(NIST 05質譜庫，WILEY 275質譜庫，美國Agilent公司)；U-3000紫外-可見分光光度計(上海譜元儀器有限公司)；生物倒置顯微鏡(Olympus CKX41)，電子天平(JA2003)，酶標儀(Multiskan MK3)；二氧化碳培養(yǎng)箱(311，Thermo公司)，超凈工作臺(DL-CJ-1N)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS)；24孔、96孔細胞培養(yǎng)板(Costar公司)；胎牛血清(無噬菌體，低內毒素，杭州四季青)；PBS(凱基生物)；胰蛋白酶(凱基生物，不含Hank′s液，不含酚紅)；DMEM高糖培養(yǎng)基(凱基生物，含雙抗)；噻唑藍(MTT，凱基生物)；Hank′s液(Solarbio公司)；PBS緩沖液(Hyclone公司)；刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司)；2-巰基乙醇、鹽酸、異丙醇、95% 乙醇、乙酸乙酯等均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

C57雄性小鼠，5～6周鼠齡，體重(20±2)g；購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號：SCXK(魯)20140007。

金銀花、忍冬葉均采自山東平邑鄭城金銀花GMP基地，經臨沂大學辛杰老師鑒定分別為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的花和葉。

2 方法與結果

2.1 揮發(fā)油樣品制備 分別稱取金銀花及忍冬葉粗粉(40目)各300 g，料液比10∶1，浸泡2 h[9-13]，采用多級蒸餾裝置(自制)，水-乙酸乙酯蒸餾，防止揮發(fā)油凝結在冷凝管，連續(xù)蒸餾12 h；得黃色乙酸乙酯液體，揮干有機溶劑。0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 氣相色譜-質譜(GC-MS)色譜條件 氣相色譜柱：HP-5MS石英彈性毛細管柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫，初始柱溫60 ℃，以5 ℃·min-1升至260 ℃，保持10 min；進樣口溫度為260 ℃；載氣：高純氮，流速1 mL·min-1；分流進樣，分流比10∶1，溶劑延遲4 min，進樣量：1 μL。

質譜離子源:電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；掃描范圍：40.00～500.00 amu；

2.3 淋巴細胞增殖試驗 小鼠室溫20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，相對濕度40%～70%，明暗交替時間為12/12 h，適應性喂養(yǎng)5 d后，隨機分為10組，每組10只，按小鼠體重給藥量不同，分為空白組、金銀花和忍冬葉揮發(fā)油提取物(1 mg·kg-1)、金銀花和忍冬葉揮發(fā)油提取物(2 mg·kg-1)、金銀花和忍冬葉揮發(fā)油提取物(4 mg·kg-1)和陽性対照組(銀耳孢糖膠囊)，0.1 mL·(10 g)-1，連續(xù)灌胃30 d后，測定免疫指標。小鼠末次給藥后，脫頸椎處死，無菌取小鼠的脾臟置盛有Hank′s液的培養(yǎng)皿中，用注射器活塞研磨，使單個細胞游離出來，經200目篩網(wǎng)過濾，用Hank′ s液洗3次，每次離心10 min(1 000 rpm)。然后將細胞懸浮于2 mL DMEM完全培養(yǎng)液中，生物倒置顯微鏡下計數(shù)，調整細胞濃度為5×106/mL。將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加入75 μL ConA液，另一孔作為對照，置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，同時加入MTT(5 mg·mL-1)50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打均勻使紫色結晶完全溶解，然后集中到96孔培養(yǎng)板中，在酶標儀上測定OD值，計算加ConA孔吸光度與不加ConA孔吸光度的差值。

2.4 分析方法 統(tǒng)計分析用SPSS 16.0軟件。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.5 金銀花、忍冬葉揮發(fā)油提取率、成分及含量分析 采用自制多級蒸餾提取設備，金銀花、忍冬葉揮發(fā)油提取率分別為0.69%、0.42%。經過GC-MS分析，得到揮發(fā)油總離子流色譜圖(見圖1～2)；采用NIST 05、WILEY 275標準質譜庫對采集到的質譜圖進行對比；通過文獻檢索、質譜分析進行化合物鑒定；通過色譜峰面積歸一化法對化合物進行定量分析。最終得到金銀花和忍冬葉揮發(fā)油成分及含量結果(見表1)。

分析表1可知，金銀花及忍冬葉揮發(fā)油種類豐富，主要包括烷烴、烯烴、炔烴、醚、酯、脂肪酸、醇、醛、酮等，分別占到總揮發(fā)油含量的94.69%、95.02%。其次，各成分在金銀花和忍冬葉揮發(fā)油中所占比例也不同，脂肪酸類分別占59.6%、60.48%，與其他文獻相比[8-12]，采用自制多級蒸餾設備，脂肪酸類提取率明顯升高；醇類分別占8.82%、9.14%；烷烴分別占5.17%、0.84%；酯類分別占8.17%、9.46%；烯烴分別占1.86%、2.7%；酮類分別占1.11%、1.24%；醛類分別占1.06%、2.37%；其他成分所占比例較小。各單體成分含量比較，金銀花和忍冬葉中均以棕櫚酸含量最高，分別占38.52%、43.77%；其次是亞油酸、芳樟醇、亞麻酸甲酯、月桂酸、硬脂酸、鄰苯二甲酸二丁酯等；這說明金銀花、忍冬葉揮發(fā)油在成分和含量上均具有較高的相似性。但同時，忍冬葉揮發(fā)油中14-甲基十五酸甲酯、香葉醇的含量較高，而金銀花揮發(fā)油中烷烴類種類較多、含量較高，這說明兩者之間也存在一定的差異性。

圖1 金銀花揮發(fā)油 GS-MS 總離子流

圖2 忍冬葉揮發(fā)油 GS-MS 總離子流

2.6 揮發(fā)油成分對小鼠淋巴細胞增殖的影響 藥理實驗結果見表2、圖3。與空白組比較，在體外培養(yǎng)條件下，金銀花和忍冬葉揮發(fā)油在一定濃度范圍內對小鼠脾淋巴細胞的轉化均具有明顯的促進作用，并呈現(xiàn)劑量與藥效顯著性正相關，即隨藥物濃度的升高，其藥理作用不斷增強。在藥物劑量為1、2 mg·kg-1時，金銀花揮發(fā)油和忍冬葉揮發(fā)油藥理活性基本相同；在藥物劑量為4 mg·kg-1時，忍冬葉揮發(fā)油活性顯著增強。根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》的有關規(guī)定，金銀花及忍冬葉3個劑量組結果為陽性，因此，判定揮發(fā)油成分具有細胞免疫功能。通過分析，發(fā)現(xiàn)忍冬葉揮發(fā)油的促淋巴細胞增殖活性均高于金銀花揮發(fā)油，這為進一步開發(fā)忍冬葉這一新藥源提供了一定的科研思路。

表1 金銀花、忍冬葉揮發(fā)油成分及含量

表2 淋巴細胞增殖測定結果(n=10)

圖3 揮發(fā)油成分對小鼠淋巴細胞增殖的影響效果

3 討論

結合大生產中金銀花揮發(fā)油易于凝結在冷凝管壁的現(xiàn)象，在傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾基礎上，通過實驗設備改進，采用水-有機溶劑多級蒸餾提取的方式，大大提高了金銀花及忍冬葉揮發(fā)油提取率。通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，金銀花與忍冬葉揮發(fā)油在種類及含量上存在一定相似性，均主要包含烷烴、烯烴、炔烴、醚、酯、脂肪酸、醇、醛、酮等成分；且均以脂肪酸類成分含量最高。同時，兩者也存在一定差異，忍冬葉揮發(fā)油中烷烴種類和含量相對較少。

金銀花揮發(fā)油藥理作用廣泛，本研究采用脾淋巴細胞轉化實驗，對比了金銀花和忍冬葉揮發(fā)油對免疫功能的藥效作用。結果顯示，在一定濃度范圍內。金銀花和忍冬葉揮發(fā)油成分均表現(xiàn)出明顯的免疫增強作用，且忍冬葉的免疫活性作用相對更強。上述研究為忍冬葉新藥源及保健開發(fā)提供了一定理論基礎，但仍需進一步明確其藥理機制。