堿誘導鴨蛋蛋清凝膠特性的變化規(guī)律

凌子庭 - 蔣愛民 - 周 佺,3 ,3 范 紅 艾民珉 - 曹媛媛 -

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.畜禽產(chǎn)品精準加工與地方安全聯(lián)合工程研究中心，廣東 廣州 510642；3.廣州市食品藥品監(jiān)督管理局審評認證中心，廣東 廣州 510000)

凝膠是指膠體粒子或高分子溶質(zhì)在分散介質(zhì)中形成整體構造而失去流動性，或膠體全體雖含有大量液體介質(zhì)但處于固化狀態(tài)的物質(zhì)[1]。蛋清可以通過熱處理、堿處理、酶處理等方式形成凝膠[2]，其凝膠特性會受到蛋白質(zhì)濃度、pH、鹽種類、加熱溫度和加熱時間等因素的影響[3-5]。在熱處理過程中，蛋清蛋白質(zhì)先從天然狀態(tài)轉變?yōu)椴糠终归_狀態(tài)(熔融球狀態(tài))，然后分子內(nèi)氫鍵和疏水相互作用的官能團在適當?shù)臈l件下形成分子間相互作用，形成凝膠網(wǎng)絡[6]。李俐鑫等[4]在pH 7的情況下采用熱處理(75 ℃以上)誘導蛋清形成了質(zhì)構特性較好的凝膠。然而，在堿性環(huán)境中，蛋清蛋白質(zhì)在較高的加熱溫度下會發(fā)生降解，從而影響凝膠的質(zhì)構等特性。Gomes等[7]發(fā)現(xiàn)加熱溫度由90 ℃上升至100 ℃時，pH 9.5的蛋清溶液熱聚集程度下降，說明在利用熱處理制備堿誘導鴨蛋蛋清凝膠時，還需要考慮加熱溫度對其凝膠特性影響。

團隊[8]前期研究表明，堿誘導鴨蛋蛋清的加堿量>0.50%時，會出現(xiàn)刺鼻堿味，影響堿誘導鴨蛋蛋清的應用。因此，研究擬在優(yōu)選的10%蛋白質(zhì)濃度的蛋清中加入0.50% NaOH的基礎上，以相隔5 ℃為梯度，選取65～95 ℃范圍內(nèi)的7個加熱溫度，采用水浴加熱方式制備堿誘導鴨蛋蛋清凝膠。通過測定流變、質(zhì)構、持水性、pH、色澤、蛋白質(zhì)電泳、網(wǎng)絡蛋白及可溶性蛋白等指標，研究溫度對堿誘導鴨蛋蛋清凝膠特性的影響，以期為熱制備具有優(yōu)良凝膠特性的堿誘導鴨蛋蛋清凝膠提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鴨蛋：廣州市天河區(qū)長湴市場；

氫氧化鈉：分析純，廣州化學試劑廠；

其他試劑均為分析純；

流變儀：MCR101型，奧地利安東帕有限公司；

凱氏定氮儀：KJELTEC8200型，丹麥福斯公司；

色差儀：Serie SP60型，美國X-Rite公司；

質(zhì)構儀：XT.AT.plus型，英國Stable Micro System公司；

高速分散機：T25數(shù)顯型，德國IKA公司；

紫外分光光度計：UV-2600型，日本島津株式會社；

pH計：PH 0-14型，德國賽多利斯公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 取新鮮鴨蛋，手工分離蛋清蛋黃并去除蛋殼及系帶，所得蛋清液用打蛋器攪打2 min后置于4 ℃冰箱靜置4 h，棄去上層泡沫備用。采用自動凱氏定氮法測定蛋清中蛋白質(zhì)的含量。根據(jù)蛋清中蛋白質(zhì)的含量取適量蛋清于燒杯中，加入適量經(jīng)滅菌處理的蒸餾水至20.00 g，所得調(diào)整后蛋清中的蛋白質(zhì)濃度為10%。邊攪拌邊加入1 mL NaOH溶液，使得蛋清中堿的質(zhì)量分數(shù)為0.50%，攪拌均勻后用保鮮膜封口，置于4 ℃冰箱靜置24 h。靜置結束后置于不同溫度的水浴鍋中加熱30 min，加熱結束后置于25 ℃、RH 50%的人工氣候培養(yǎng)箱中平衡12 h。

1.2.2 pH測定 稱取蛋清凝膠5.000 g，在1∶15的稀釋比例下按GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》測定樣品pH值。

Type: Vietnam. Transplant collected from Son La Province, Van Ho District, Tan Xuan Municipality, Cot Moc Village, at ca. 1000 m a.s.l. 20°40′33.3″N, 104°39′0.3″E, 10 Nov 2015, L. Averyanov, CPC 7158a,b /13279 (holotype, LE, not seen).

1.2.3 色澤測定 取整塊凝膠樣品，置于透明塑料袋中，利用色差儀測定樣品色澤。L*值代表亮度，其值越小，亮度越暗。a*代表紅綠方向顏色變化，-a*值為綠色，+a*值為紅色。b*值代表藍黃方向顏色變化，-b*值為藍色，+b*值為黃色。

1.2.4 動態(tài)黏彈性溫度掃描 上樣初始溫度20 ℃，上樣后平衡3 min，角速度1 rad/s，應變1%。升溫階段與冷卻階段的溫度變化速度為2 ℃/min，掃描范圍20～95 ℃。

1.2.5 可溶性蛋白含量測定 準確稱取2.000 g蛋清凝膠，加入38 mL蒸餾水，以10 000 r/min分散2 min，然后置于離心機中，在4 ℃下5 000 r/min離心15 min。利用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標準曲線[9]。

1.2.6 網(wǎng)絡蛋白含量測定 參考Wu等[10]的方法并略作修改：凝膠樣品切成1.5 mm的薄片，轉移一定樣品(精確到0.01 g)到帶旋蓋的瓶子中，按料液比1∶20(g/mL)加入0.01 mol/L、pH 7的磷酸鈉緩沖液。溶液中加入0.02% NaN3抑制細菌生長。將瓶子置于25 ℃的水浴中輕輕震蕩，使非網(wǎng)絡蛋白從凝膠片中擴散54 h。擴散結束時，用鑷子取出凝膠片，并用0.01 mol/L、pH 7的磷酸鈉緩沖液漂洗2次。漂洗后的凝膠片的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定，結果即為網(wǎng)絡蛋白含量。

1.2.7 持水性測定 參考王健一等[11]的方法并略作修改：將樣品切成1 cm×1 cm×1 cm的立方體記錄其質(zhì)量(m1)，用一層濾紙包裹，置于50 mL離心管中，離心管底部放置脫脂棉，用于吸水。在4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，離心完畢后取出樣品并稱重(m2)，按式(1)計算持水性。

(1)

式中：

WHC——持水性，%；

m1——離心前質(zhì)量，g；

m2——離心后質(zhì)量，g。

1.2.8 十二烷基硫酸鈉—丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 參照Laemmli[12]的方法略作修改：稱取3 g蛋白凝膠樣品，添加5% SDS 27 mL，以12 000 r/min均質(zhì)1 min。勻漿在85 ℃加熱1 h，然后置于離心機中，在室溫下7 500×g離心10 min。取上清液100 μL，1∶1加入樣品處理液，搖勻后進行5 min沸水浴。取樣品10 μL注入濃縮膠的凹槽。垂直式凝膠電泳裝置進行電泳，采用60 V和120 V電壓，電泳后的凝膠置于20%甲醇、10%乙酸和0.25%考馬斯亮藍染色液中染色(85 ℃，15 min)，然后用20%甲醇和10%乙酸脫色，直至背景清晰。

1.2.9 凝膠質(zhì)構 參考陳青等[13]的方法并略作修改：采用質(zhì)構分析儀進行應力松弛測試。選用的夾具為P/0.5 s，測試模式為 HOLD TEST。具體測試參數(shù)為測前速度2 mm/s，測中速度1 mm/s，測后速度2 mm/s，壓縮應變50%，觸發(fā)力5 g，測試時間180 s。測試結果取下壓過程最大的回彈力為堅實度，測試結束時的回彈力與堅實度的比值為彈性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各指標重復測定3次，采用Origin 9.5軟件繪圖，利用Photoshopcs6進行電泳圖顏色處理，利用SPSS 18進行Pearson相關性分析，數(shù)據(jù)顯著性則利用 SPSS 18進行單因素ANOVA分析。

2 結果與分析

2.1 溫度對蛋清凝膠pH及色澤的影響

根據(jù)凝膠的pH檢測結果，隨著加熱溫度的升高，蛋清凝膠的pH值由加熱前的11.18逐漸下降至95 ℃的10.78。色澤檢測結果顯示，蛋清凝膠發(fā)生較明顯的褐變現(xiàn)象，在95 ℃時呈棕褐色。pH值的降低可能與蛋清受熱過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)降解和美拉德反應相關[14-16]。在熱和堿的共同作用下，OH-作為反應物參與蛋白質(zhì)降解，導致OH-被消耗，pH值下降。另外，美拉德反應過程中，糖和Amadori化合物的降解產(chǎn)物含有有機酸[14]，因此隨著溫度的升高，美拉德反應逐漸增強，有機酸產(chǎn)量逐漸升高，中和了環(huán)境中的OH-，導致蛋清pH值顯著下降(P<0.05)。

由表1可知，蛋清凝膠隨著加熱溫度的上升，L*值顯著降低(P<0.05)，表明蛋清凝膠的亮度降低，即凝膠顏色越接近黑色，樣品發(fā)生褐變的程度越高；a*值由負值轉向正值，表明樣品顏色逐漸向紅色加深；b*值始終為黃色，數(shù)值先增大后減少，表明蛋清在添加0.50% NaOH后，加熱形成的凝膠帶有黃色色澤，而這種色澤為黃色的一種或數(shù)種化學產(chǎn)物具有熱不穩(wěn)定性，可能在溫度>85 ℃時發(fā)生分解或合成新的物質(zhì)，顏色褪去，故而b*值在升高至19.14后逐漸下降至8.68。

表1 不同加熱溫度下蛋清凝膠的pH和色澤的變化?

? 同列字母不同表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 溫度對蛋清流變特性的影響

由圖1可以看出：添加NaOH的蛋清加熱前就形成了凝膠狀態(tài)(G′>G”)；在升溫階段，隨著溫度的升高，添加NaOH的蛋清G′約在54 ℃改變下降趨勢并迅速增大，在74 ℃時到達最大值，而后逐漸下降；未添加NaOH的蛋清G′在71 ℃時迅速增大，93 ℃時達到最大值，最終G′值遠大于添加NaOH的蛋清。說明添加0.50% NaOH明顯改變了蛋清對溫度的敏感性，添加NaOH的蛋清可以在較低的溫度形成剛度更大的凝膠，但加熱溫度>80 ℃時其剛度低于未添加NaOH的蛋清；添加NaOH的蛋清在加熱溫度達到74 ℃時，G′開始下降，說明蛋清的凝膠結構容易在熱及NaOH共同作用下被破壞。冷卻階段結果如圖2所示，兩種蛋清均形成了G′更高的凝膠，Mine[6]認為這是氫鍵重新生成并穩(wěn)定凝膠結構導致的。在冷卻后，添加NaOH的蛋清形成的凝膠G′值較未添加NaOH的蛋清G′值低，說明在加熱階段被破壞的凝膠結構不會恢復，最終添加NaOH的蛋清加熱形成的凝膠較軟。

圖1 升溫階段儲能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化

2.3 溫度對蛋清凝膠網(wǎng)絡蛋白、可溶性蛋白及持水性的影響

利用緩沖溶液長時間浸泡切成薄片的蛋清凝膠，溶出未形成網(wǎng)絡蛋白的蛋白質(zhì)，則可以通過測量凝膠片的蛋白質(zhì)含量測得凝膠的網(wǎng)絡蛋白含量[10]。如圖3所示，當加熱溫度升高至90 ℃以上時，網(wǎng)絡蛋白含量出現(xiàn)明顯的下降(P<0.05)，由75 ℃的8.15%下降至95 ℃的7.21%；而蛋清凝膠的可溶性蛋白含量75 ℃時開始出現(xiàn)顯著的升高(P<0.05)，由4.77 g/L上升至95 ℃的10.82 g/L；相關性分析結果顯示，網(wǎng)絡蛋白含量與可溶性蛋白的結果呈較好的相關性(r=-0.912，P<0.01)。說明蛋清凝膠的網(wǎng)絡結構因過度受熱和堿處理而受損[3,7,17]，部分形成網(wǎng)絡蛋白的蛋白質(zhì)降解成可溶性蛋白或多肽并被緩沖溶液溶出。同時，根據(jù)Han等[18]的研究結果，凝膠的持水性與凝膠結構有較大的相關性，凝膠結構越細密持水性越好。由圖4可知，蛋清凝膠的持水性隨加熱溫度的升高呈先上升后下降趨勢，在75 ℃時的持水性最好，為 89.02%。當加熱溫度>75 ℃時，持水性顯著下降(P<0.05)，95 ℃時持水性僅有79.03%。表明蛋清的凝膠結構會在高熱、高堿環(huán)境被破壞，適度加熱有利于蛋清形成細密的凝膠結構。

同項目字母不同表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

Figure 3 Effects of heating temperature on netting proteins and soluble proteins in egg white gel

字母不同表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

2.4 溫度對蛋清凝膠蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的影響

根據(jù)新鮮鴨蛋蛋清蛋白質(zhì)的組分在凝膠電泳中的情況，從上到下可觀察到蛋清的可溶性蛋白主要分為卵黏蛋白(110 kDa)、卵轉鐵蛋白(76 kDa)、卵球蛋白(49 kDa)、卵白蛋白(44.5 kDa)和溶菌酶(14.4 kDa)[19-20]。對比新鮮蛋清和加堿后放置24 h的蛋清蛋白質(zhì)組分，觀察到加入0.50% NaOH后，蛋清中的各類蛋白質(zhì)均在一定程度上受到OH-的影響，其中溶菌酶、卵黏蛋白、卵轉鐵蛋白、卵球蛋白條帶完全消失，表明這幾種蛋白對0.50% NaOH不耐受，在堿的作用下全部發(fā)生變性、聚合或降解[17,19,21]；卵白蛋白仍有較清晰的條帶，但條帶明顯變淡，可能由于卵白蛋白含量較多且具有一定的耐堿能力，因此卵白蛋白在堿的作用下并未全部變性，在電泳圖譜上仍存在較明顯的條帶。根據(jù)Hagolle等[22]研究結果顯示，卵白蛋白變性的起始溫度約為68 ℃，峰值約在84 ℃。因此在85 ℃及以上的加熱條件下，大部分卵白蛋白變性，在電泳圖譜(圖5)上顯示為卵白蛋白條帶變淺直至消失。施加65 ℃以上的溫度處理鴨蛋蛋清，分離膠上部出現(xiàn)分子量>97.4 kDa的顏色較深的新條帶，表明大部分蛋清蛋白質(zhì)發(fā)生變性、相互聚集形成大分子蛋白[19,21,23]；同時，加熱溫度達到90，95 ℃時，整個泳道均有拖尾現(xiàn)象，表明在高熱和堿性環(huán)境下，大分子蛋白被降解，形成分子量不一的蛋白質(zhì)片段，這種大分子蛋白被降解的現(xiàn)象對形成高強度的蛋清凝膠不利。

圖5 不同加熱溫度條件下鴨蛋蛋清凝膠的SDS-PAGE圖譜

2.5 溫度對蛋清凝膠質(zhì)構特性的影響

如圖6所示，蛋清凝膠的堅實度由加熱前的68.88 g上升至70 ℃的最大值652.35 g，而后持續(xù)下降至95 ℃的380.35 g；蛋清凝膠的彈性則逐漸由加熱前的45.20%上升至95 ℃的77.50%。顯然，通過對添加0.50% NaOH蛋清施加60 ℃以上的熱處理，顯著改善了蛋清凝膠的堅實度和彈性(P<0.05)。當加熱溫度由65 ℃上升至70 ℃時，蛋清蛋白質(zhì)中占比較大的卵白蛋白開始發(fā)生熱變性[22]，參與形成網(wǎng)絡凝膠結構，蛋清凝膠的堅實度出現(xiàn)顯著增強(P<0.05)。隨著加熱溫度逐漸升高和存在較多OH-的情況下，凝膠的網(wǎng)絡結構局部分解越來越嚴重、蛋白質(zhì)的熱聚集效應降低[5,19-21,24]，蛋白質(zhì)二級結構遭受破壞、二硫鍵和疏水相互作用減少[24]，導致蛋清凝膠的堅實度逐漸下降，說明加入NaOH后過高的加熱溫度不利于形成具有優(yōu)良質(zhì)構特性的蛋清凝膠。根據(jù)Zhao等[5]的研究，NaOH處理會導致蛋清蛋白分子的損傷，形成具有松散線性網(wǎng)狀結構的高彈性凝膠[17,19]，這一結果也可以用于解釋蛋清蛋白凝膠的彈性隨溫度上升而逐漸升高的情況。

同項目字母不同表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

2.6 蛋清理化性質(zhì)與凝膠質(zhì)構特性的相關性分析

為進一步闡明蛋清理化性質(zhì)與凝膠質(zhì)構特性的關系，進行了Pearson相關分析。如表2所示，溫度與凝膠的pH、網(wǎng)絡蛋白和可溶性蛋白均有較好的線性關系(P<0.05)，表現(xiàn)為溫度越高，pH和網(wǎng)絡蛋白越低，可溶性蛋白含量越高。凝膠的堅實度與溫度呈顯著負相關(P<0.05)，表明溫度越高，凝膠堅實度越差。此外，凝膠的堅實度與網(wǎng)絡蛋白呈極顯著的正相關(P<0.01)，與可溶性蛋白呈極顯著的負相關(P<0.01)，說明網(wǎng)絡蛋白和可溶性蛋白均可用于描述蛋清凝膠的情況：形成網(wǎng)絡蛋白的蛋白質(zhì)越多，凝膠的堅實度越高。凝膠的彈性則僅與溫度呈正相關(P<0.05)，說明在高溫破壞蛋清凝膠的結構后，凝膠松散線性網(wǎng)狀結構反而具有更高的彈性。

表2 不同加熱溫度下蛋清凝膠的理化特性與質(zhì)構特性的相關系數(shù)?

Table 2 Correlation coefficient between physicochemical properties and texture properties of egg white gel at different heating temperatures

特性溫度pH網(wǎng)絡蛋白可溶性蛋白持水性溫度1.000-0.944??-0.803?0.937??-0.329堅實度-0.824?0.916??0.911??-0.905??0.627彈性0.891??-0.747-0.4790.7440.050

? “*”表示相關系數(shù)在0.05水平上顯著；“**”表示相關系數(shù)在0.01水平上顯著。

3 結論

研究了65～95 ℃加熱溫度對添加0.50% NaOH的鴨蛋蛋清凝膠特性的影響，結果顯示：隨著加熱溫度的上升，蛋清的凝膠結構會被堿及高熱環(huán)境破壞，堅實度和持水性呈先上升后下降的趨勢，蛋清凝膠的非酶褐變程度加深。當加熱溫度為70 ℃時，蛋清凝膠的質(zhì)構特性較為優(yōu)良。試驗僅探究了0.50% NaOH添加量條件下的蛋清凝膠變化，下一步可探究其他NaOH添加量的蛋清凝膠變化，并從化學作用力、透射電子顯微鏡等方面剖析其深層機理。