常琳琳，王桂霞，孫 瑞，董 靜，張運濤

（北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京市草莓工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，100093）

草莓是美國重要的經(jīng)濟作物，作為全世界草莓生產(chǎn)第二大國，美國的草莓產(chǎn)量占世界草莓總產(chǎn)量的17%[1]。美國的草莓生產(chǎn)90%集中在加利福尼亞州，其次是佛羅里達州，佛羅里達州以生產(chǎn)冬草莓為主[2-3]。

美國國家草莓種質(zhì)資源圃位于美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心、俄勒岡州科瓦利斯市，保存草莓資源1 951 份，主要的保存方式是在隔離網(wǎng)室內(nèi)保存盆栽草莓，并在1 951 份資源中確定約40 份資源為核心資源，主要為原產(chǎn)于美洲的八倍體，這些資源可直接作為育種材料。筆者主要介紹美國國家草莓種質(zhì)資源圃在草莓資源保存、鑒定和分發(fā)利用等方面的方式方法，旨在為我國草莓資源保存利用工作提供借鑒。

1 草莓資源的保存

美國國家草莓種質(zhì)資源圃針對草莓資源的保存主要有4 種方式：隔離網(wǎng)室保存、組培離體保存、低溫保存和超低溫保存，共保存資源1 951 份，其中隔離網(wǎng)室保存（圖1）和低溫保存是主要的保存方式，組培離體保存（圖2）和超低溫保存屬于復(fù)份保存。隔離網(wǎng)室中保存有草莓品種資源500 余份，野生資源1 000 余份，主要采用大花盆盆栽（以防資源混雜），每盆3 株，一般品種資源保存2 盆，野生資源保存1 盆，采用滴灌的方式灌溉。為防止昆蟲等飛入，隔離網(wǎng)室設(shè)計雙層門。每3 年移栽1次，每次移栽前對植株進行病毒檢測和品種純度鑒定，采用低成本的ELISA 方法檢測6 種病毒：蘋果花葉病毒（ApMV）、樹莓環(huán)斑病毒（RpRSV）、草莓潛隱環(huán)斑病毒（SLRSV）、草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）、草莓壞死休克病毒（SNSV）和番茄環(huán)斑病毒（ToRSV）。品種基因型鑒定采用SSR 分子標(biāo)記。通過病毒檢測及品種純度鑒定的資源進行移栽，如果植株攜帶病毒，就需要接取匍匐莖莖尖進行脫毒或用脫毒的組培苗替換。病毒主要通過蚜蟲和線蟲傳播，通過土壤消毒基本可以杜絕線蟲；蚜蟲可通過噴藥控制，因此隔離網(wǎng)室中病毒病的傳播并不嚴(yán)重。1 951 份資源中，共確定出40 份核心資源，主要是智利草莓和弗州草莓，這些資源擁有良好的性狀，可以直接用于育種。每年春夏季節(jié)，隔離網(wǎng)室中最重要的一項工作就是去掉所有資源的花和果，如果果實成熟，種子會掉入花盆，一旦萌發(fā)就會混雜原有資源。低溫保存主要是保存一些草莓種子資源，置于冰箱中冷凍，保存溫度是-20 ℃，可以保存長達幾年或十幾年。組培離體保存主要采用STAR*PAC 組培袋保存，培養(yǎng)基中不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑，置于人工培養(yǎng)箱中［4 ℃，微弱光照（12 h 光照、12 h 黑暗）］可保存1～2 年，但需每3 個月檢查1 次植株是否健康。若發(fā)現(xiàn)隔離網(wǎng)室中植株感染病毒，可組培STAR*PAC 中保存的資源予以替換。超低溫保存是一種長期保存資源的方式，將植株放在裝有培養(yǎng)基的保存管中，套在一個圓筒里，可以一直保存在液氮中。

種子的制備方法與國內(nèi)使用的方法類似，都是采用榨汁機進行操作，但有2 點不同：第一，榨汁機的刀頭采用專門的膠粘住，這樣降低了鋒利程度，減小了對種皮的破壞度；第二，使用榨汁機處理前，在自封袋中加入0.002 g/mL 的果膠酶，將草莓按碎，加入少量水，放置3～4 d。此操作可以去掉種子上殘留的草莓果肉，使制備的種子更干凈。制備完成后的種子，用種子計數(shù)機（圖3）數(shù)清數(shù)量，將資源名稱、制備時間、數(shù)量信息標(biāo)記在紙袋上，放置于塑料袋中，于冰箱中保存。

圖1 隔離網(wǎng)室中保存的草莓資源

圖2 STAR＊PAC 組培袋中離體保存的草莓資源

圖3 種子計數(shù)機正在記錄種子數(shù)量

2 草莓資源的脫毒

在隔離網(wǎng)室中，若發(fā)現(xiàn)草莓植株感染病毒，先對植株進行標(biāo)記（插上彩色旗子），將其轉(zhuǎn)移至感染網(wǎng)室中，等待抽生匍匐莖，剪取莖尖。剪取莖尖時，每剪取1 份資源的莖尖，使用的剪子就要在消毒液中清洗1 次，以防把病毒等傳播給其他資源。在體式顯微鏡下剪取0.2 mm 大小的莖尖，置于一種24 孔的組培盒（圖4）中，這種組培盒可以隔離污染，同時減少培養(yǎng)基的用量。莖尖分化成苗后，轉(zhuǎn)移到指形管中培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)移到方形盒中培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基組分與國內(nèi)所用培養(yǎng)基組分類似。剪取組培苗的葉片進行病毒檢測，確定脫除病毒后用脫毒苗替換感染病毒的植株。

圖4 用于培養(yǎng)草莓莖尖的24 孔組培盒

3 草莓資源的鑒定

保存在隔離網(wǎng)室中的資源不允許開花結(jié)果，因此如計劃鑒定植株的植物學(xué)和生物學(xué)性狀特征，需將資源定植在露地進行調(diào)查。調(diào)查的性狀包括：開花時間、匍匐莖抽生時間及數(shù)量、果實成熟時間、果實重量、果柄長度、果形、果實顏色、花冠直徑、植株高度、花朵總數(shù)、花序位置、萼片直徑、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、花青素含量及總酚含量。與國內(nèi)鑒定不同的是，開花時間、果實成熟時間等與日期相關(guān)的性狀，一般采用羅馬儒略歷進行記錄；果實顏色、果形等性狀采用數(shù)字代碼進行記錄（與DUS 測試指南行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)類似）。記錄資源感染草莓病害的情況，病害包括：炭疽病、白粉病、葉枯病、葉斑病、紅中柱根腐病，根據(jù)發(fā)病程度，賦予相應(yīng)的數(shù)值。

4 草莓資源的分發(fā)利用

美國國家草莓種質(zhì)資源圃有專職人員負責(zé)資源的分發(fā)，可以提供匍匐莖、組培苗、花粉、花朵和種子，匍匐莖只在7 月中旬提供，組培苗和種子任何時間都可提供。申請人可以發(fā)郵件下訂單，聯(lián)系需要的資源和材料類型，負責(zé)人按照訂單進行準(zhǔn)備，快遞給需要的單位或個人，所有資源免費提供，但這些資源不允許用于商業(yè)目的。如果需要國際快遞，郵費由申請人承擔(dān)。

從1981 年到2013 年5 月，美國國家草莓種質(zhì)資源圃共提供資源材料1.5 萬份，其中鳳梨草莓約7 600 份，需求量最大的10 份資源是‘馬歇爾’（Marshall）、‘費爾法克斯’（Fairfax）、擇捉草莓（F.iturupensis）、‘魏瑟阿納薩’（Weisse Anasa）、麝香草莓（F.moschata）‘Capron’、麝香草莓（F.moschata）‘Profumata di Tortuna’、‘早光’（Earliglow）、‘全明星’（Allstar）、森林草莓（F.vesca）‘Yellow Wonder’和‘布萊克莫爾’（Blakemore）[4]。一些研究病理的科研人員還會索取一些攜帶病毒的植株進行科學(xué)研究。如果中國擬引進草莓資源，必須提供引種許可證明。

5 我國草莓資源的保存現(xiàn)狀及建議

目前，我國共收集保存各類草莓種質(zhì)資源超過1 000 份，其中品種資源400 余份、野生資源600余份（22 個種），保存方式多以田間種植為主，同時進行了離體保存。品種資源和部分野生資源主要保存在北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院2 個國家草莓種質(zhì)資源圃，野生資源主要保存在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，其他一些科研單位、高校和私人公司也保存著草莓資源。保存的草莓資源主要用于國內(nèi)交換和利用。

針對我國草莓資源的保存和利用現(xiàn)狀提出幾點建議：草莓資源的保存數(shù)量有待進一步增加，近些年，與國外的交流日漸頻繁，可通過各種途徑從國外引進優(yōu)新的草莓品種和野生資源；完善草莓資源的保存體系，加強對草莓資源的保存力度，學(xué)習(xí)美國在草莓資源方面的保存方式，力求保存和分發(fā)利用潔凈的草莓苗木；豐富分發(fā)利用的材料類型，目前，提供的資源類型主要是苗木，以后也可為有需要的單位和團體提供花粉、花朵和種子進行研究利用。