萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素工藝的研究

徐曉輝，王莉潔，孫丹，郭健

（1.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院健康營(yíng)養(yǎng)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110163；2.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110163）

天然產(chǎn)物及其衍生物的使用存在嚴(yán)重的供應(yīng)問(wèn)題[1]。在許多情況下，當(dāng)某種植物成為一種商業(yè)化草藥或者其中某個(gè)成分開(kāi)始用于制藥時(shí)，由于大規(guī)模的野外采伐和不可持續(xù)的采收技術(shù)，使其數(shù)量受到威脅[2]。雖然栽培作為一種可持續(xù)的方法可以替代野外采伐，但在50 000種藥用植物中，有2/3依然來(lái)自野外采收，使得4 000～10 000種藥用植物瀕臨滅絕[3]。此外，植物來(lái)源的化合物結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，多數(shù)情況下不具備利用化學(xué)合成生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)可行性[4]。

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供了另外一種獲得藥用化合物的方式[5]。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在：（1）是一個(gè)連續(xù)生產(chǎn)系統(tǒng)，不受環(huán)境條件影響和限制；生產(chǎn)是在限定的可控條件下完成的，無(wú)農(nóng)用化學(xué)品，可以更好地控制產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量；（2）生物量積累迅速，目標(biāo)化合物產(chǎn)率高；（3）下游分離、純化過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了有害溶劑的使用，更加環(huán)境友好[6]。迄今為止，已經(jīng)有17種藥用化合物可以利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，其中大規(guī)模生產(chǎn)的主要有：來(lái)自紫草（Lithospermum erythrorhizon）的抗炎藥物紫草素；來(lái)自短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的抗癌藥物紫杉醇；來(lái)自人參（Panax ginseng）并具有心臟保護(hù)作用的人參皂甙[7]。

葉黃素經(jīng)常用作改善眼部健康的補(bǔ)充劑，能夠預(yù)防和改善年齡相關(guān)性黃斑變性和白內(nèi)障[8]，但是人體不能合成葉黃素，完全依賴于從飲食中攝取來(lái)滿足對(duì)葉黃素的需求[9]。目前，商業(yè)化生產(chǎn)的葉黃素主要提取自萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta L.）的花瓣[10]。然而，從萬(wàn)壽菊的花瓣中提取來(lái)生產(chǎn)葉黃素會(huì)受到鮮花的季節(jié)性供應(yīng)、土地需求大、需要大量技術(shù)工人以及葉黃素含量低等因素限制[11]。此外，萬(wàn)壽菊中葉黃素有兩種存在形式，分別為游離葉黃素和葉黃素酯，其中葉黃素酯占80%～100%[12]，葉黃素酯必須經(jīng)過(guò)皂化反應(yīng)除去脂肪酸，才能得到游離葉黃素[13]，提取和純化過(guò)程比較復(fù)雜?；谏鲜鱿拗菩砸蛩?，迫切需要建立新的葉黃素來(lái)源，用于其商業(yè)化生產(chǎn)，以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。

在前期研究中，以萬(wàn)壽菊花瓣為外植體構(gòu)建得到能夠生產(chǎn)游離葉黃素的萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系，并建立了培養(yǎng)細(xì)胞中葉黃素的超高效液相色譜分析方法[14]。因此通過(guò)考察細(xì)胞培養(yǎng)條件以及誘導(dǎo)子等對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中葉黃素合成的影響，建立懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)葉黃素的生產(chǎn)工藝，為下一步中試放大培養(yǎng)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（ACQUITYTMUPLC，Waters，美國(guó)）；純水/超純水一體化系統(tǒng)（MING-CHE 24UV，Merck Millipore，法國(guó)）；超聲波清洗器（KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（5430R，Eppendorf AG，德國(guó)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；移液器（Research?plus，Eppendorf AG，德國(guó)）。

葉黃素（Sigma-Aldrich，美國(guó)）；乙腈（HPLC級(jí)，Sigma-Aldrich，美國(guó)）；甲醇（HPLC級(jí)，F(xiàn)isher Scientific，美國(guó)）；甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水楊酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；茉莉酸甲酯（Sigma-Aldrich，美國(guó)）。

1.2 色譜條件[14]

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈-甲醇（90∶10，v/v），B為水；梯度洗脫程序：0.0～2.5 min，90%A；2.5～3.0 min，90%～100% A；3.0～6.0 min，100% A；6.0～6.5 min，100%～90% A；6.5～9.5 min，90% A。柱溫：25 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：448 nm。

1.3 萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基為MS（Murashige and Skoog，1962）基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1 mg/L NAA（1-Naphthaleneacetic acid），1 mg/L KT（kinetin），30 g/L蔗糖。用1 mol/L NaOH將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到5.8，然后116 ℃滅菌30 min。細(xì)胞每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，接種密度為75 g/L。所用搖瓶為100 mL，內(nèi)裝20 mL培養(yǎng)基。搖瓶以雙層鋁箔紙封口，置于100 r/min的搖床上光照培養(yǎng)，溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為8 000 Lx，光照時(shí)間為24 h/d。

1.4 細(xì)胞生物量的測(cè)定方法

1.4.1 細(xì)胞鮮重

將細(xì)胞樣品倒入布氏漏斗中，減壓抽濾除去培養(yǎng)基，用去離子水清洗至少3次后稱重，所得為細(xì)胞鮮重（Fresh cell weight）。

1.4.2 細(xì)胞干重

減壓抽濾后的細(xì)胞樣品置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h至恒重，然后稱重，所得為細(xì)胞干重（Dry cell weight）。

1.5 誘導(dǎo)子溶液的配制及添加方法

將茉莉酸甲酯（MJA）和水楊酸（SA）分別溶于無(wú)水乙醇中，配制成儲(chǔ)備液。在生物安全柜內(nèi)，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜注射過(guò)濾除菌后，添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中。

1.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和游離葉黃素生產(chǎn)的影響

分別于細(xì)胞生長(zhǎng)的第0 d、3 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d、24 d和28 d取樣，測(cè)定細(xì)胞鮮重和細(xì)胞干重，并利用UPLC測(cè)定細(xì)胞中游離葉黃素的含量，計(jì)算培養(yǎng)細(xì)胞中游離葉黃素的體積產(chǎn)率。

1.7 誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和游離葉黃素生產(chǎn)的影響

于細(xì)胞生長(zhǎng)的第7 d，在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞液體培養(yǎng)基中分別添加終濃度為10 μmol/L的水楊酸以及10 μmol/L的茉莉酸甲酯，在細(xì)胞生長(zhǎng)的第14 d收獲細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞鮮重、細(xì)胞干重以及細(xì)胞中游離葉黃素的含量，計(jì)算細(xì)胞中游離葉黃素的體積產(chǎn)率。

1.8 光照對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和游離葉黃素生產(chǎn)的影響

將培養(yǎng)細(xì)胞分成兩組，其中一組按照1.3中所述方法進(jìn)行光照培養(yǎng)；另一組進(jìn)行暗培養(yǎng)，其它培養(yǎng)條件均完全相同。培養(yǎng)第14 d收獲細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞鮮重、細(xì)胞干重以及細(xì)胞中游離葉黃素的含量，計(jì)算細(xì)胞中游離葉黃素的體積產(chǎn)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

植物細(xì)胞的生長(zhǎng)一般可分為以下4個(gè)階段：延滯期（Lag phase）、指數(shù)期（Exponential phase）、穩(wěn)定期（Stationary phase）和衰亡期（Decline phase）。萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。可以看出，對(duì)于萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞鮮重和細(xì)胞干重的積累表現(xiàn)出基本相同的規(guī)律。第0～3 d為延滯期，在此階段，細(xì)胞剛剛轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，還處在適應(yīng)階段，逐漸恢復(fù)分裂能力。第3～14 d為指數(shù)期，細(xì)胞一方面通過(guò)分裂，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目的增多；另一方面，通過(guò)細(xì)胞體積的增大，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生物量的快速積累。第14～21 d為穩(wěn)定期，細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降，新生的細(xì)胞數(shù)和死亡的細(xì)胞數(shù)相當(dāng)，細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值。第21～28 d為衰亡期，細(xì)胞停止生長(zhǎng)和分裂，開(kāi)始衰老和死亡。

圖1 萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

在細(xì)胞生長(zhǎng)的第14 d，細(xì)胞鮮重達(dá)到最大值；在細(xì)胞生長(zhǎng)的第21 d，細(xì)胞干重達(dá)到最大值，為13.04±2.15 g/L。鑒于培養(yǎng)細(xì)胞從14 d進(jìn)入穩(wěn)定期，且就細(xì)胞干重而言，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，第14 d、17 d以及21 d，無(wú)顯著性差異?？紤]生產(chǎn)成本和發(fā)酵周期，以懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生物量為參數(shù)時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞收獲的最佳時(shí)間為細(xì)胞生長(zhǎng)的第14 d。在細(xì)胞生長(zhǎng)的第14 d，細(xì)胞鮮重為225.86±12.99 g/L，為第0 d的7.9倍；細(xì)胞干重為12.43±0.49 g/L，為第0 d的4.9倍。

2.2 細(xì)胞中游離葉黃素的生產(chǎn)曲線

萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中游離葉黃素的生產(chǎn)曲線如圖2所示。萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中游離葉黃素的積累和細(xì)胞生物量的積累（細(xì)胞干重）具有相同的規(guī)律，幾乎完全吻合。這表明，萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素和細(xì)胞生長(zhǎng)是偶聯(lián)的?；诖?，在下一步中試放大培養(yǎng)階段，可以通過(guò)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生物量的快速積累，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)游離葉黃素。

萬(wàn)壽菊培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素，在細(xì)胞生長(zhǎng)的第14 d，開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，一直持續(xù)到第24 d，然后游離葉黃素的產(chǎn)率開(kāi)始下降。游離葉黃素的產(chǎn)率在細(xì)胞生長(zhǎng)的第21 d達(dá)到最大值，體積產(chǎn)率為1.57±0.52 mg/L。同細(xì)胞生長(zhǎng)曲線一樣，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，葉黃素產(chǎn)率在細(xì)胞生長(zhǎng)的第14 d、17 d、21 d以及24 d，無(wú)顯著性差異?？紤]生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期，培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素時(shí)，細(xì)胞收獲的最佳時(shí)間為細(xì)胞生長(zhǎng)的第14 d。在細(xì)胞生長(zhǎng)的第14 d，游離葉黃素產(chǎn)率為1.29±0.09 mg/L，為第0 d的8.48倍。

圖2 萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中游離葉黃素的生產(chǎn)曲線

2.3 誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和游離葉黃素生產(chǎn)的影響

分別添加誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯（MJA）和水楊酸（SA）對(duì)萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響如圖3所示。添加茉莉酸甲酯和添加水楊酸的兩個(gè)處理組之間，細(xì)胞鮮重接近，且均低于對(duì)照組細(xì)胞，處理組與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異；而對(duì)于細(xì)胞干重而言，對(duì)照組細(xì)胞與處理組細(xì)胞，3組值都接近，且無(wú)顯著性差異。上述結(jié)果表明，以茉莉酸甲酯或者以水楊酸作為誘導(dǎo)子添加，對(duì)萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)均無(wú)顯著性影響。

圖3 茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

分別添加誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素的影響如圖4所示。由圖4可知，添加茉莉酸甲酯組細(xì)胞中游離葉黃素的產(chǎn)率與對(duì)照組細(xì)胞產(chǎn)率接近，無(wú)顯著性差異，但兩者均高于添加水楊酸組細(xì)胞中游離葉黃素的產(chǎn)率。上述結(jié)果表明，以茉莉酸甲酯或者以水楊酸作為誘導(dǎo)子，對(duì)萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素?zé)o顯著性促進(jìn)作用。

圖4 茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)游離葉黃素生產(chǎn)的影響

2.4 光照對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和游離葉黃素生產(chǎn)的影響

光照培養(yǎng)、暗培養(yǎng)以及暗培養(yǎng)添加茉莉酸甲酯3種培養(yǎng)條件下，萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況如圖5所示。由圖5可知，就細(xì)胞鮮重而言，光照組細(xì)胞最高，且與暗培養(yǎng)細(xì)胞之間為顯著性差異，而暗培養(yǎng)添加茉莉酸甲酯組細(xì)胞鮮重最低，細(xì)胞干重亦顯示出相同的規(guī)律，說(shuō)明暗培養(yǎng)以及暗培養(yǎng)添加茉莉酸甲酯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，光照對(duì)于萬(wàn)壽菊懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用。

圖5 光照對(duì)萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

光照培養(yǎng)、暗培養(yǎng)以及暗培養(yǎng)添加茉莉酸甲酯3種培養(yǎng)條件下，萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素的情況如圖6所示。由圖6可知，3組細(xì)胞中游離葉黃素的產(chǎn)率以光照培養(yǎng)組細(xì)胞中最高，達(dá)到1.95±0.17 mg/L，而暗培養(yǎng)組細(xì)胞中游離葉黃素的產(chǎn)率僅為0.34±0.02 mg/L，暗培養(yǎng)添加茉莉酸甲酯組細(xì)胞中游離葉黃素產(chǎn)率為0.32±0.01 mg/L。光照培養(yǎng)組細(xì)胞中游離葉黃素產(chǎn)率為暗培養(yǎng)組細(xì)胞產(chǎn)率的5.7倍；光照培養(yǎng)組細(xì)胞游離葉黃素產(chǎn)率為暗培養(yǎng)添加茉莉酸甲酯組細(xì)胞產(chǎn)率的6.1倍。上述結(jié)果表明，光照對(duì)于萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素具有顯著促進(jìn)作用。推測(cè)這可能與葉黃素是光合色素有關(guān)。同時(shí)，暗培養(yǎng)條件下，茉莉酸甲酯對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)葉黃素?zé)o顯著性影響。

圖6 光照對(duì)游離葉黃素生產(chǎn)的影響

3 結(jié)論

通過(guò)建立萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素的工藝，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞最佳收獲時(shí)間為生長(zhǎng)的第14 d，此時(shí)為穩(wěn)定期。萬(wàn)壽菊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)游離葉黃素和細(xì)胞生長(zhǎng)是偶聯(lián)的，可以通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生物量的快速積累，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)游離葉黃素，這對(duì)于下一步中試放大培養(yǎng)意義重大。光照是葉黃素合成的關(guān)鍵因素，能夠顯著促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)游離葉黃素。茉莉酸甲酯和水楊酸不能促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞中游離葉黃素的合成。在暗培養(yǎng)條件下，茉莉酸甲酯不能替代光照誘導(dǎo)游離葉黃素的合成。

未來(lái)需根據(jù)葉黃素的生物合成途徑，選擇合適的方法實(shí)現(xiàn)有效的過(guò)程調(diào)控。同時(shí)，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)合成途徑中的關(guān)鍵酶等進(jìn)行改造，以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器放大培養(yǎng)階段葉黃素的穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)。