廖亮，王琴容，楊國(guó)輝

1 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽(yáng)550004；2 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

在高等真核細(xì)胞生物中，基因表達(dá)的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜而嚴(yán)格的調(diào)控過(guò)程，涉及許多不同的因素和控制水平。生物體內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成RNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵過(guò)程,基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。基因分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的趨勢(shì)之一是逐漸從基因結(jié)構(gòu)和功能分析轉(zhuǎn)到基因順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制上,對(duì)基因調(diào)控的研究將是今后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)功能基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1]。目前，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)已成為研究轉(zhuǎn)錄因子參與基因調(diào)控的有效手段,通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子DNA片段的分析，驗(yàn)證啟動(dòng)子結(jié)合元件的反式激活能力,探討轉(zhuǎn)錄因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的分子機(jī)制[2]，在分子生物學(xué)中常用來(lái)研究基因功能、基因與基因間的調(diào)節(jié)、蛋白與基因的作用以及非編碼RNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[3]。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)中，海腎熒光素酶為報(bào)告基因，螢火蟲(chóng)熒光素酶為內(nèi)參基因，兩個(gè)熒光素酶基因都有自己的啟動(dòng)子、終止位點(diǎn)，二者獨(dú)立表達(dá)且互不干擾[4]。常見(jiàn)雙熒光素酶報(bào)告基因載體有pGL3-Basic、pRL-TK等，但是pGL3-Basic載體只表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶，而pRL-TK載體則只表達(dá)海腎熒光素酶，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)需將兩個(gè)載體共同轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中。本研究應(yīng)用了由Promega公司研發(fā)的一種雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2，它同時(shí)含有以上兩種報(bào)告基因，即雙熒光素酶報(bào)告基因整合在同一個(gè)載體上，使檢測(cè)偏差更小且質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更簡(jiǎn)單易行。在psiCHECK-2載體質(zhì)粒中，海腎熒光素酶被用作主要的報(bào)告基因，將目的基因克隆到位于海腎熒光素酶下游的多克隆位點(diǎn)，通過(guò)比較過(guò)表達(dá)或者干擾miRNA后檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)，可以定量反應(yīng)miRNA對(duì)目的基因的調(diào)控作用[5]，還可結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA和靶基因3′UTR的作用位點(diǎn)[6]；此外，該載體質(zhì)粒還可以用來(lái)驗(yàn)證miRNA同長(zhǎng)鏈非編碼RNA的靶向作用，鑒定特定轉(zhuǎn)錄因子同其調(diào)控序列的作用以及分析信號(hào)通路激活等[7]。2019年3月10日～2019年6月9日，我們成功構(gòu)建了雙熒光素酶報(bào)告重組基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron，觀察其轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9后細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒光素酶的表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、試劑及細(xì)胞 雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2購(gòu)自美國(guó)Promega公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DNA轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自北京碼因科技公司；提取總RNA的TRIzol試劑以及普通PCR試劑購(gòu)自Invitrogen公司；gDNA Eraser、Reverse Transcription、T4 DNA Ligase試劑盒以及SYBR Green試劑盒購(gòu)自Takara公司；PCR儀購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司StepOnePlus ；雙熒光酶檢測(cè)試劑采用購(gòu)自于GeneCopoeia公司的Luc-Pair Duo-Luciferase；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9及感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)時(shí)RT-PCR引物由上海生工生物公司合成。

1.2 重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron的構(gòu)建與鑒定 以psiCHECK-2中的嵌合體內(nèi)含子(設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為133 bp)為模板，分別設(shè)計(jì)含有相關(guān)酶切位點(diǎn)的特異性引引物。嵌合體內(nèi)含子正向引物5′- GTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCG-

ACCCTGCAGCGACCCGCTTAAAAGCTTGGCATTCCG-GTAAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGG-3′，反向引物為5′- GCAGGGCCCTTCTTAATGTTCTTAGCATC-GGCCATGGTGGCTTTACCAACCTGTGGAGAGAAAG-GCAAAG -3′；海腎熒光素酶基因正向引物為5′- TGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTG -3′，反向引物為5′- TGCTCGGGGTCGTACACCTTGGAA -3′；螢火蟲(chóng)熒光素酶基因正向引物為5′- AAAGCTTGGCATTCCGGTAAGGTT -3′，反向引物為5′- GTGGGCATCGGTGAAGGCAA -3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，58 ℃、30 s，72 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物和psiCHECK-2載體質(zhì)粒用快速連接試劑盒在16 ℃溫度下連接12 h，即獲得重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron。取重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron，轉(zhuǎn)染至感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5α中，然后接種于Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)平板上，培養(yǎng)48 h后篩選出單克隆菌落，以嵌合體內(nèi)含子為目的基因片段，常規(guī)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，觀察目的基因片段長(zhǎng)度，并對(duì)目的基因片段進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3 重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒光素酶檢測(cè)

1.3.1 重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶基因、海腎熒光素酶基因檢測(cè) 將PC-9細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，期間每隔24 h更換培養(yǎng)基一次，待細(xì)胞完全貼壁以后，用0.25%胰蛋白酶將其消化并傳代，按照Entranster-H4000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)要求分別將重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron、雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞中，記為轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組，采用qRT-PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶mRNA、海腎熒光素酶mRNA。用TRIzol試劑提取PC-9細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括cDNA 0.5 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、無(wú)菌水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶mRNA、海腎熒光素酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒光素酶活性檢測(cè) 采用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)。取兩組細(xì)胞放入96孔板，加入80 μL細(xì)胞裂解液裂解10 min，然后加入螢火蟲(chóng)熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，使用BioTek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)兩組細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶活性、海腎熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron的鑒定結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察到目的基因片段長(zhǎng)度為133 bp，與預(yù)期設(shè)計(jì)的目的片段長(zhǎng)度相符，證明嵌合體內(nèi)含子成功插入psiCHECK-2載體中。重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron的基因測(cè)序結(jié)果顯示，嵌合體內(nèi)含子目的基因序列正確，無(wú)突變和缺失，表明重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建成功。重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。

注：圖中箭頭方向代表轉(zhuǎn)錄的方向，∧代表插入的嵌合體內(nèi)含子目的基因片段。

圖1重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron結(jié)構(gòu)圖

2.2 重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron轉(zhuǎn)染細(xì)胞PC-9中螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒光素酶的表達(dá) 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶mRNA、海腎熒光素酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.213±0.038、2.004±0.025，對(duì)照組分別為1.004±0.012、1.003±0.010，兩組相比，P均<0.05。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶活性、海腎熒光素酶活性分別為2.974±0.099、1.948±0.052，對(duì)照組分別為1.000±0.018、1.000±0.020，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

在高等真核細(xì)胞生物中，基因表達(dá)的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜而嚴(yán)格的調(diào)控過(guò)程，涉及許多不同的因素和控制水平。生物體內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成RNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵過(guò)程,基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。基因分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的趨勢(shì)之一是逐漸從基因結(jié)構(gòu)和功能分析轉(zhuǎn)到基因順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制上,對(duì)基因調(diào)控的研究將是今后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)功能基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。本研究選用的psiCHECK-2載體巧妙的將兩個(gè)熒光素酶報(bào)告基因融合在同一質(zhì)粒上，這樣可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)兩種熒光素酶活性，而不必分開(kāi)進(jìn)行檢測(cè)，因此可以在很大程度上避免在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中質(zhì)粒DNA污染樣本的對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，并省略了在逆轉(zhuǎn)錄前必須加入DNase去除DNA的繁瑣過(guò)程，從而進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)操作的效率，節(jié)省了時(shí)間，而且也能在很大限度上減少樣本污染的機(jī)率，同時(shí)也在最大程度上減少了不同批次內(nèi)和批次間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差異，為科研工作帶來(lái)了很大便利。本研究中，我們以psiCHECK-2載體質(zhì)粒為基本框架，通過(guò)在螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因上游插入嵌合體內(nèi)含子，構(gòu)建重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron，分別應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)和基因測(cè)序結(jié)果顯示重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建成功。

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)插入的嵌合體內(nèi)含子在一定程度上增強(qiáng)了螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron轉(zhuǎn)染PC-9細(xì)胞后，螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒光素酶的表達(dá)均發(fā)生了變化。在真核生物的細(xì)胞中，內(nèi)含子已被證實(shí)能顯著促進(jìn)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)[8]。另一項(xiàng)研究[9]證實(shí)，內(nèi)含子能促進(jìn)綠色熒光蛋白(GFP)在293T細(xì)胞中的表達(dá)。還有研究[10]表明，嵌合體內(nèi)含子能夠大幅度提高重組神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中的表達(dá)，并且證實(shí)了內(nèi)含子調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有方向性。另外，還有一些內(nèi)含子對(duì)于基因的表達(dá)有直接或間接的負(fù)面影響[11,12]。其中的機(jī)制目前還不清楚，有待進(jìn)一步的研究探討。本研究選擇PC-9細(xì)胞系作為受試細(xì)胞，是因?yàn)镻C-9細(xì)胞具有容易培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)和高轉(zhuǎn)染效率等特點(diǎn)[13]，所以選擇該細(xì)胞來(lái)進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度更高。

總之，本研究成功構(gòu)建了重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron；重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron轉(zhuǎn)染PC-9細(xì)胞后，細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒光素酶的表達(dá)均升高。該質(zhì)粒的成功構(gòu)建為下一步研究沉默基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞PC-9上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響提供了一種新的實(shí)驗(yàn)手段和工具。