王小言 夏鷹 彭俊 金虎 陳偉明 陳曉東 聶柳 鄭忠濤

阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)典型病理學(xué)改變主要為大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞外有大量淀粉樣蛋白斑塊形成，β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積可引起細(xì)胞凋亡，在AD發(fā)病機制中起重要作用[1-2]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，在高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥、脂多糖(LSP)誘導(dǎo)的炎癥、AD及多種癌癥中發(fā)揮重要作用，且與磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路密切相關(guān)[3-7]，但MALAT1是否在大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用尚鮮有報道。PC12細(xì)胞具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，廣泛作為模型細(xì)胞用于神經(jīng)生理學(xué)和藥理學(xué)研究[8]。本研究通過建立Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡損傷模型，旨在觀察下調(diào)MALAT1表達對PC12細(xì)胞凋亡損傷及PI3K/Akt通路的影響，為AD發(fā)病機制及靶向治療提供一定理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供。

1.2 主要試劑及儀器高級DMEM培養(yǎng)基(12491-023)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，胎牛血清(FBS，10099141)購自美國Gibco公司，Aβ1-42(SIGMA-A9810)購自美國Sigma，MALAT1及其內(nèi)參引物序列、MALAT1干擾序列和對照組序列均由廣州銳博生物科技有限公司合成，Trizol試劑(R0016)為上海碧云天公司產(chǎn)品，TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus，RR820A)、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)均購自TaKaRa公司，Lipofectamine? 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(11668-1.5 mL)、兔源一抗p-PI3K(MA5-14870)、Cleaved-caspase3(700182)、二抗羊抗鼠IgG(A-11001)、羊抗兔IgG(A-11008)均購自美國Invitrogen公司，兔源一抗AKT(ab18785)、p-AKT(ab38449)、PI3K(ab70912)、Bcl-2(ab185002)、Bax(ab32503)、β-actin抗體(ab179467)購自英國Abcam公司，CCK-8試劑盒(YT128)購自北京百奧萊博生物科技有限公司，AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒(APOAF)購自美國Sigma公司。FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，F(xiàn)C酶標(biāo)儀、Forma Steri-Cycle i160 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司，IX73倒置顯微鏡購自日本Olympus公司等。

1.3 方法

1.3.1PC12細(xì)胞培養(yǎng)及分組：PC12細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS、1%(體積分?jǐn)?shù))輕鏈霉素DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代消化時用0.25%(質(zhì)量濃度)胰蛋白酶消化。將對數(shù)期生長PC12細(xì)胞消化計數(shù)后接種于6孔細(xì)胞板，每孔約1×106個細(xì)胞，培養(yǎng)基2 mL，待細(xì)胞匯合至50%～60%時，更換含10mol/L Aβ1-42培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷建立損傷模型[9]。將培養(yǎng)的PC12細(xì)胞隨機分為正常對照組、模型組、sh-對照組及sh-MALAT1組，每組6個復(fù)孔。sh-MALAT1組在模型組處理基礎(chǔ)上采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染MALAT1干擾序列(5′-GGCTCTTCCTTCTGTTCTA-3′)，以觀察干擾MALAT1后對Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響；sh-對照組：即干擾組陰性對照，轉(zhuǎn)染MALAT1干擾對照序列(5′-TTCTCCGAACGTGTC-ACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGA- A-3′)，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行；正常對照組：無任何處理正常生長的PC12細(xì)胞。各組PC12細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至24 h后進行后續(xù)試驗。

1.3.2MALAT1表達水平檢測：收集“1.2.1”中各組PC12細(xì)胞，添加Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)純度及濃度檢測合格后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)試劑盒進行MALAT1擴增，MALAT1上游引物序列為：5′- GTGATGCGAGTTGTTCTCCG-3′，下游引物序列為：5′- CTGGCTGCCTCAATGCCTAC -3′；內(nèi)參β-actin上游引物序列為：5′- GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，下游引物序列為：5′- AATGTCACGCACGATTTCCC -3′，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)條件設(shè)置：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40個循環(huán)；添加溶解曲線。MALAT1相對表達量采用2-ΔΔCT法進行分析。

1.3.3PC12細(xì)胞存活檢測：將對數(shù)期生長PC12細(xì)胞消化計數(shù)后，培養(yǎng)結(jié)束后以5×104個/mL接種于96孔細(xì)胞板培養(yǎng)24 h后，每孔添加10L CCK-8，培養(yǎng)箱中孵育3 h，酶標(biāo)儀測定各組PC12細(xì)胞各孔570 nm處吸光度值，按下列公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=處理組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.3.4PC12細(xì)胞凋亡檢測：收集各組PC12細(xì)胞，添加0.5 mL結(jié)合緩沖液混勻懸浮細(xì)胞，每個待檢樣品分別添加5L AnnexinⅤ-FITC、PI，室溫避光孵育20 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞凋亡率。

1.3.5PC12細(xì)胞PI3K/Akt通路及下游凋亡相關(guān)蛋白表達：提取各組PC12細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測562 nm處樣品蛋白含量。取80g蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，恒壓轉(zhuǎn)膜，5%(體積分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉120 min，PBST沖洗3次，每次20 min。分別添加一抗AKT(1∶1000)、p-AKT抗體(1∶1000)、PI3K抗體(1∶50)、p-PI3K抗體(1∶1000)、Bcl-2抗體(1∶500)、Bax抗體(1∶500)、Cleaved-caspase3抗體(0.1 ～0.2 μg/mL)、β-actin抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，PBST 緩沖液洗3次，每次 20 min，用適量含2%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(1∶5000)室溫孵育1 h后，洗膜，顯色，暗室滴加ECL發(fā)光液，曝片拍照，應(yīng)用Image J圖像分析軟件分別計算各蛋白條帶灰度值，以靶蛋白條帶與β-actin蛋白條帶比值表示靶蛋白相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞存活率、凋亡率及MALAT1表達比較4組間細(xì)胞存活率、凋亡率及MALAT1表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。兩兩比較結(jié)果顯示，模型組與sh-對照組間MALAT1表達、PC12細(xì)胞存活率及凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與正常對照組比較，模型組、sh-對照組MALAT1表達水平、PC12細(xì)胞凋亡率高(P<0.05)，而PC12細(xì)胞存活率低(P<0.05)；與模型組和sh-對照組比較，sh-MALAT1組MALAT1表達水平、PC12細(xì)胞凋亡率減低(P<0.05)，而PC12細(xì)胞存活率高(P<0.05)。結(jié)果見表1和圖1。

2.2 各組PC12細(xì)胞PI3K/Akt通路及下游凋亡相關(guān)蛋白表達4組PC12細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Cleaved-caspase3/caspase3、Bax及Bcl-2蛋白表達水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。兩兩比較顯示，模型組組和sh-對照組PC12細(xì)胞上述各蛋白表達水平差異比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；與正常對照組比較，模型組、sh-對照組PC12細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白表達水平低(均P<0.05)，而Cleaved-caspase3/caspase3、Bax蛋白水平高(均P<0.05)；與模型組和sh-對照組比較，sh-MALAT1組PC12細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及Bcl-2蛋白表達水平高(均P<0.05)，而Cleaved-caspase3/caspase3、Bax蛋白表達低(均P<0.05)。結(jié)果見表2、圖2～3。

表1 各組PC12細(xì)胞存活率、凋亡率及MALAT1表達水平比較

注：MALAT1：肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1；與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組和sh-對照組分別比較，bP<0.05

圖1 各組PC12細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

表2 各組PC12細(xì)胞不同蛋白相對表達水平比較

組別p-PI3K/PI3Kp-Akt/AktCleaved-caspase3/caspase3BaxBcl-2正常對照組1.04±0.150.36±0.050.03±0.011.37±0.151.32±0.14模型組0.38±0.07a0.12±0.01a0.94±0.12a2.18±0.17a0.11±0.06ash-對照組0.40±0.08a0.11±0.02a0.95±0.13a2.19±0.16a0.12±0.05ash-MALAT1組0.91±0.14ab0.32±0.07ab0.36±0.07ab1.58±0.14ab1.16±0.11abF值52.56652.127135.97843.578270.577P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶，p-PI3K：磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶，Akt：蛋白激酶B，p-Akt：磷酸化蛋白激酶B，caspase3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，Bax：B-細(xì)胞白血病淋巴瘤-2-相關(guān)X蛋白；Bcl-2：B-細(xì)胞淋巴瘤因子2；圖2～3同。與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組和sh-對照組分別比較，bP<0.05

圖2 各組PC12細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達條帶圖 圖3 各組PC12細(xì)胞Cleaved-caspase3、caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達條帶圖

3 討論

AD是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床多表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能減退，好發(fā)于中老年人群，且發(fā)病率呈逐年增加趨勢，是繼心血管疾病和腫瘤后引起老年人死亡的第三大病因[10]。目前臨床尚無特效治療藥物，因此研究AD發(fā)生、發(fā)展機制可能對臨床尋找AD靶向治療藥物具有重要意義。Aβ是正常細(xì)胞內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)的裂解產(chǎn)物，神經(jīng)元信息主要通過PI3K/Akt通路進行傳導(dǎo)，其下傳受阻可導(dǎo)致Aβ異常沉積，Tau樣蛋白過度磷酸化，促進神經(jīng)元凋亡，進而導(dǎo)致AD發(fā)生[11]。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株，能合成多巴胺等兒茶酚胺類物質(zhì)，且含多巴胺代謝相關(guān)酶，在功能和形態(tài)上更接近多巴胺能神經(jīng)元，臨床常用于神經(jīng)藥理、病理研究，Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷已成為研究AD一種常用細(xì)胞模型[12]。

MALAT1位于人類染色體11q13.1，是一種致癌性lncRNA，在口腔鱗癌、骨肉瘤等多種腫瘤中表達上調(diào)，可促進腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等[13-14]，還可參與免疫調(diào)節(jié)過程，在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中高表達，與炎性反應(yīng)有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組組、sh-對照組MALAT1表達、PC12細(xì)胞凋亡率高，而PC12細(xì)胞存活率低；與模型組和sh-對照組比較，sh-MALAT1組MALAT1表達水平、PC12細(xì)胞凋亡率低，而PC12細(xì)胞存活率高，提示P12細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功，Aβ1-42可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，可能與MALAT1升高有關(guān)，干擾MALAT1后可下調(diào)損傷PC12細(xì)胞中MALAT1水平，降低PC12細(xì)胞凋亡率，促進其存活。

PI3K/Akt通路是一條重要凋亡抑制通路，在神經(jīng)元損傷存活中發(fā)揮重要作用。PI3K活化后可激活下游蛋白Akt，活化后的Akt可調(diào)節(jié)其下游多種凋亡相關(guān)基因，促進凋亡基因失活，進而抑制神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組、sh-對照組PC12細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白以及Bcl-2蛋白表達水平低，Bax蛋白表達高，與Aβ1-42組、sh-Crtl組比較，sh-MALAT1組PC12細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白表達水平升高，Cleaved-caspase3/caspase3、Bax蛋白表達降低，推測下調(diào)MALAT1可能通過促進p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達激活PI3K/Akt通路，磷酸化后的Akt可編碼下游凋亡蛋白Cleaved-caspase3/caspase3、Bax、CytC和Bcl-2等蛋白表達，提示下調(diào)MALAT1可能通過激活PI3K/Akt通路抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，發(fā)揮保護作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，下調(diào)MALAT1表達可能通過激活PI3K/Akt通路，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax、Cleaved-caspase3蛋白表達抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，這可能對AD發(fā)生、發(fā)展機制研究及靶向藥物研發(fā)提供新的靶點，但具體作用機制尚需進一步研究。