圣草酚對實驗性結腸炎小鼠Nrf2/HO-1通路的影響

王 茹 沈 磊 (武漢大學人民醫(yī)院消化內科，消化系統(tǒng)疾病湖北省重點實驗室,武漢 430060)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因不明，慢性、非特異性炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，常累及結腸、直腸，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、血便等。近年來有研究認為Nrf2/HO-1通路與UC發(fā)生、發(fā)展密切相關，是抗氧化損傷的重要通路，可以負性調控炎癥因子，Nrf2基因缺失可導致UC的加重，通過激活Nrf2通路可以對UC起到保護作用[1-4]，因此尋找抗氧化、抗炎作用強的靶向藥物，或許為UC治療帶來新的希望。

圣草酚(eriodidoyol，EDT)是一種存在于蔬菜和橘柑類水果中的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、降血脂、免疫調節(jié)等作用。既往研究表明：EDT可下調 LPS在人單核細胞白血病細胞系THP-1中誘導的IL-1β、IL-6、IL-8，和TNF-α等炎癥因子水平[5]，在LPS誘導的小鼠急性肺損傷模型中，EDT通過激活Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗氧化、抗炎作用，從而改善肺損傷程度[6]，在順鉑誘導的小鼠腎損傷模型中，EDT可以通過激活Nrf2和抑制NF-κB活化，起到抗氧化、抗炎作用來減輕順鉑誘導的腎損傷[7],EDT還通過激活Nrf2信號通路，起到抗氧化作用，保護神經(jīng)元免受β淀粉樣蛋白25-35肽誘導的細胞死亡[8]，然而EDT在結腸炎中的作用及其機制尚未被研究，因此，本研究的目的是確定EDT對小鼠結腸炎的保護作用及對Nrf2/HO-1通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級(無特定病原體)雄性C57BL/6小鼠32只，6～8周齡，體重20～22 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證號：SCXY(京)2016-0006，合格證號,11400700317396)。

1.1.2試劑 EDT(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：Y12O8H45552)；DSS(美國MP Biomedicals 公司，批號：Q6182)；Nrf-2 抗體(美國Santa Cruz Biotechnology 公司，批號：0112017)；辣根過氧化物酶標記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；MPO測試盒、SOD測試盒、MDA測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理 將32只C57BL/6小鼠隨機分為4 組:空白對照組、DSS模型組及EDT低、高劑量組(20、40 mg/kg),每組8只。飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院動物中心SPF環(huán)境下，實驗前適應1周，溫度(21±2)℃，濕度(50±5)%，每日12 h光照與黑暗交替，自由飲水和進食。實驗開始后，對照組小鼠飲用蒸餾水，其余各組均自由飲用3%DSS溶液7 d，制成潰瘍結腸炎模型。EDT低、高劑量組在造模第1天同時腹腔注射EDT 20、40 mg/kg，空白對照組及DSS模型組腹腔注射等量的生理鹽水，1次/d，共7 d。實驗期間，每天觀察記錄各組小鼠體重、糞便性狀及便血情況，進行DAI 評分[9]，如表1。第8天頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取出整段結腸，測量長度， 并將距肛門2 cm處結腸剪下1 cm，組織固定于4%多聚甲醛，進行脫水、浸蠟、透明、包埋、切片，HE 染色。其余部分保存于-80℃冰箱，用于結腸組織MDA含量、MPO和SOD活性檢測、RT-PCR和Western blot檢測。

1.2.2結腸組織病理檢查及評分 在光鏡下觀察HE切片，對小鼠結腸損傷情況進行病理學評分[10]，如表2。

1.2.3檢測結腸組織MDA含量、MPO和SOD活性 MDA含量、MPO和SOD活性嚴格按照試劑盒說明書，使用試劑盒進行檢測。

1.2.4RT-PCR檢測Nrf-2、HO-1、NOQ1、TNF-α、IL-6 mRNA的表達 使用Trizol試劑，根據(jù)說明書從結腸組織樣品中分離總RNA，并將總RNA反轉錄為cDNA，進行實時PCR。引物序列如表3。

1.2.5Western blot檢測核Nrf2、HO-1、NOQ1蛋白的表達 取腸組織在RIPA緩沖液中勻漿30 min，用BCA測定法檢測蛋白質濃度。用相關試劑盒提取腸組織的核和細胞質蛋白。在12%SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質并轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%脫脂乳將膜封閉2 h，然后用HO-1、Nrf2、NOQ1和一抗在4℃溫育過夜。將膜用PBST洗滌3次，然后在室溫下用HRP偶聯(lián)的二抗孵育2 h。并用增強型化學發(fā)光試劑ECL顯影,分析灰度值。

表1 疾病活動指數(shù)評分標準

Tab.1 DAI scoring system

ScoreWeight loss(%)Stool consistencyBlood stool0NoneNormalNegative11-5NormalNegative25-10Loose stoolHemoccult positive310-15Loose stoolHemoccult positive415-20DiarrheaGross bleeding

表2 結腸組織病理學評分

Tab.2 Histopathological score

Items012 3 4Percent of tissue damageNo≤25%≤50%≤75%≤100%Extent of tissue damageNoMucosaMucosa and submucosaBeyond submucosaDegree of inflammationNoSlight ModerateSevereExtent of crypt damageNoBasal 1/3Basal 2/3Only surface epitheliumwas intactEntire crypt andepithelium were lost

2 結果

2.1疾病活動指數(shù)(DAI)評分 開始造模后，模型組部分小鼠于第2天出現(xiàn)大便隱血陽性，在3～4 d開始出現(xiàn)腹瀉、血便，并逐漸加重，體重下降明顯，DAI評分較高；對照組小鼠未出現(xiàn)體重下降、腹瀉、血便，給藥組(EDT 20 mg/kg,40 mg/kg)，體重下降、便血情況較模型組程度輕，DAI評分降低(P<0.01)，呈劑量依賴性，如圖1A。

2.2結腸長度變化 與對照組相比，模型組結腸長度明顯縮短(P<0.05),與模型組相比，給藥組(EDT 20 mg/kg,40 mg/kg)，結腸長度明顯變長(P<0.05)，呈劑量依賴性，如圖1B。

2.3小鼠結腸組織病理學評分 光鏡下觀察，模型組小鼠結腸黏膜結構不完整，出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，周圍腺體排列紊亂，上皮及隱窩破壞明顯，給藥組(EDT 20 mg/kg,40 mg/kg)，小鼠結腸黏膜結構較模型組破壞程度輕，結腸黏膜結構大致完整，炎癥細胞浸潤較少,如圖1D所示。病理組織學評分顯示：與空白組比較，模型組評分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，EDT低濃度組、高濃度組評分均顯著降低(P<0.01)，呈劑量依賴性，如圖1C。

2.4結腸組織MDA含量、MPO和SOD活性 與空白對照組相比，模型組MDA含量明顯增多、MPO活性明顯提高(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01);與模型組相比，EDT給藥組活性明顯降低，SOD活性明顯提高(P<0.05)，如下圖2。

2.5炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA的結果 與空白組比較，模型組結腸組織中TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.01)，EDT低、高劑量組結腸組織中TNF-α、IL-6含量顯著降低(P<0.01,P<0.05)，如圖3。

表3 PCR引物序列

Tab.3 Primers used for RT-PCR

GenesPrimerSequenceβ-actinF5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3' R5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'TNF-αF5'-ACCCTCACACTCACAAACCA-3' R5'-GGCAGAGAGGAGGTTGACTT-3'IL-6F5'-GTTGCCTTCTTGGGACTGAT-3' R5'-ATTAAGCCTCCGACTTGTGA-3'Nrf2F5'-CAGTGCTCCTATGCGTGAA-3'R5'-GCGGCTTGAATGTTTGTCT-3'HO-1F5'-TGACAGAAGAGGCTAAGACCG-3'R5'-AGTGAGGACCCACTGGAGGA-3'NOQ1F5'-CGCCTGAGCCCAGATATTGT-3'R5'-GGAAAGGACCGTTGTCGTAC-3'

2.6Nrf2、HO-1、NOQ1 mRNA及Nrf2、HO-1、NOQ1蛋白表達的結果 與空白組比較，模型組Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，EDT低、高劑量組結腸組織中Nrf2、HO-1、NOQ1相對mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，且呈劑量依賴性，如圖4。

圖1 各組小鼠結腸炎嚴重程度評估Fig.1 Assessment of severity of colitis in each group ofmiceNote: A.Disease activity index was measured;B.Colon lengths were examined;C.The histopathology score was determined (n=8),compared with DSS model group ,*.P<0.05;**.P<0.01;D.Images of histological changes in colon stained (HE,×200).

圖2 結腸組織中MPO含量、MDA、SOD水平(n=8)Fig.2 MPO content,MDA and SOD levels in colon(n=8)Note: Compared with DSS model group,*.P<0.05，**.P<0.01.

圖3 結腸組織中TNF-α、IL-6相對mRNA含量(n=8)Fig.3 mRNA expression of TNF-α and IL-6 in colon(n=8)Note: Compared with DSS model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 結腸組織中Nrf2、HO-1、NOQ1蛋白及相對mRNA水平(n=8)Fig.4 Nrf2,HO-1，NOQ1 protein and mRNA levels in colon(n=8)Note: Compared with DSS model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

UC臨床上難以治愈，極易復發(fā)，隨著經(jīng)濟發(fā)展，在我國發(fā)病率也逐漸增高，目前病因及發(fā)病機制尚不明確，一般認為可能與異常免疫調節(jié)、環(huán)境變化、遺傳易感性、腸道持續(xù)感染、腸黏膜屏障損傷等因素有關[11，12]。近年來研究表明氧化應激在IBD發(fā)病機制中起重要作用。IBD患者的腸道中，炎癥細胞活化產生炎癥因子及大量的活性氧，過量的活性氧可逆或不可逆破壞可氧化的生物分子，包括膜分子，引起黏膜細胞脂質過氧化損傷。MDA是脂質過氧化和損傷的重要標志。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，可以清除生物體內的自由基，其水平的高低可以反映機體的抗氧化能力。

Nrf2是一種對氧化還原敏感的轉錄因子，是Cap-N-Collar轉錄因子家族的成員之一。Nfr2具有亮氨酸拉鏈結構[13]，在抗氧化反應中起著關鍵作用。生理狀態(tài)下，其處于非活性狀態(tài)存在于胞質中，當細胞處于氧化應激時，Nrf2轉入核內與sMaf或Jun結合形成異二聚體。異二聚體與抗氧化反應元件(ARE)結合，促進編碼下游Ⅱ期解毒和抗氧化酶的基因的表達，包括HO-1、SOD和NOQ1，從而提高細胞去除親電子和ROS的能力[14]。Nrf2/HO-1通路還能負性調控炎癥因子TNF-α、IL-6等，減輕氧化應激和炎癥因子對機體的損傷[15]。研究表明，在UC中，結腸組織的Nrf2表達與氧化應激有關，隨著氧化應激強度增加，Nrf2的含量增加[16]。在實驗性小鼠結腸炎模型中，已經(jīng)證明Nrf2基因敲除會加重小鼠的結腸損傷，Nrf2-/-小鼠通過減少HO-1等抗氧化酶并增加TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達對DSS誘導的UC有高度易感性[4]，而藥物激活Nrf2會對結腸產生保護作用[3,17]。

MPO是中性粒細胞分泌的一種酶，其活性變化可間接反映中性粒細胞浸潤的數(shù)量及程度,是評價炎癥程度的指標。當細胞中MPO水平升高時，可促進炎癥效應細胞的增殖與活化，使效應細胞更易于穿越內皮屏障到達局部炎癥組織，可進一歩導致結腸炎癥的形成[18]。

本研究結果顯示：與空白組相比，模型組小鼠體重下降明顯，便血程度嚴重，結腸長度明顯縮短等顯示本次實驗造模成功。與模型組相比，EDT治療干預后小鼠體重下降程度減低，糞便性狀、便血情況明顯改善，DAI評分顯著降低，結腸縮短程度降低，結腸組織病理學評分顯著降低，這提示EDT對DSS誘導的小鼠結腸炎具有一定的緩解作用。而且EDT給藥組MDA含量、MPO活性降低，SOD活性增高，TNF-α、IL-6 mRNA表達降低，Nrf2、HO-1、NOQ1 mRNA明顯升高，Western blot檢測核內Nrf2、HO-1、NOQ1蛋白表達顯著增加，以上表明EDT可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，降低炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA的表達，減少MDA和 MPO產生，增強SOD活性，從而減少結腸氧化損傷，增強抗氧化能力，并減輕腸道炎癥對小鼠結腸炎腸道損傷起到保護作用。

綜上所述，EDT可能通過激活Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗氧化、抗炎作用來減輕小鼠實驗性結腸炎的嚴重程度，為UC尋求新的治療方式奠定了一定實驗基礎。但本實驗尚存在不足之處，僅初步探討了EDT干預實驗性結腸炎后Nrf2/HO-1通路中Nrf2、HO-1、NOQ1表達的變化情況，不能完全說明EDT是通過Nrf2/HO-1通路對小鼠結腸炎發(fā)揮保護作用，EDT是否通過其他途徑發(fā)揮保護作用還有待進一步研究。在今后的研究中，本課題組將使用Nrf2抑制劑阻斷Nrf2通路來進一步驗證上述結論。