銀杏酮酯對抑郁大鼠腦內(nèi)ERK1/2及其磷酸化水平的影響①

李 寧 周珊珊 胡 蕊 高媛媛 王潮敏 王育梅

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科，石家莊 050000)

抑郁癥是情緒障礙綜合征，嚴(yán)重影響人們身心健康，且具有較高致死率。抑郁癥發(fā)病時主要通過慢性應(yīng)激導(dǎo)致前額葉與海馬為主的腦區(qū)中神經(jīng)元細(xì)胞損傷甚至凋亡，從而損害患者認(rèn)知功能[1,2]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)作為絲分裂活化蛋白激酶通路的主要組成部分，具有抵抗細(xì)胞損傷與促進生長的作用，其表達水平影響患者的行為能力，與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。銀杏酮酯(ginkgo biloba extract,GBE)作為新型銀杏葉提取物制劑，主要成分為銀杏黃酮與銀杏內(nèi)酯，能改善模型大鼠抑郁樣行為，抑制NLRP3炎癥小體活性，減少促炎癥因子分泌[4,5]。本實驗采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激配合分養(yǎng)建立抑郁大鼠模型，給予不同劑量GBE干預(yù)，通過比較各個實驗組大鼠前額葉與海馬ERK1/2 mRNA與蛋白表達及其磷酸化水平，探討銀杏酮酯對抑郁大鼠行為學(xué)的保護作用及其影響機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 SPF級SD大鼠50只，雄性，體重180～220 g，由河北醫(yī)科大學(xué)提供，合格證號：SYXK(冀)2013-0023。除對照組外，其余各組單籠分養(yǎng)，室溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食與飲水。銀杏酮酯(上海杏靈科技藥業(yè)有限公司)；ERK1/2、p-ERK1/2激酶活性定量檢測試劑盒(美國Cell Signaling公司)；β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立 采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激配合分養(yǎng)法建立抑郁大鼠模型[6,7]。造模前對各組大鼠進行曠場試驗、糖水消耗試驗。造模大鼠單籠飼養(yǎng)，每天隨機接受1種不同刺激，包括2 h束縛行為、45°傾籠、24 h濕籠、連續(xù)5次/1 min電擊足底30次、4℃冰水游泳5 min、4℃熱水游泳5 min、夾尾5 min、24 h禁水、24 h禁食、晝夜顛倒24 h，連續(xù)造模21 d。

1.2.2分組與給藥 將大鼠隨機分為5組，分別為對照組、模型組、銀杏酮酯低、中、高劑量組，每組10只。除對照組外，模型組與銀杏酮酯低、中、高劑量組大鼠均進行造模處理。造模成功后，銀杏酮酯低、中、高劑量組大鼠分別灌胃50、100、200 mg/(kg·d)的銀杏酮酯，連續(xù)給藥28 d。對照組與模型組給予等體積的生理鹽水。

1.2.3糖水消耗試驗 撤去食物和水，于籠子中央放置相同體積1%蔗糖水和飲用水，觀察大鼠5 h自由飲水情況。5 h后交換蔗糖水與飲用水位置，繼續(xù)觀察大鼠5 h，計算糖水?dāng)z入百分比：攝入蔗糖水百分比=蔗糖水量/(蔗糖水量+飲用水量)×100%。

1.2.4曠場試驗 采用80 cm×80 cm×60 cm的不透明墻壁組成的立方體箱。試驗于上午7:30～ 12:00安靜環(huán)境下進行。記錄大鼠10 min內(nèi)行程(水平運動)、后肢直立次數(shù)(垂直運動)，行為學(xué)得分=水平運動得分+垂直運動得分。每次實驗徹底清潔曠場后再進行下一只大鼠的觀察。

1.2.5ERK1/2、p-ERK1/2 mRNA表達水平的檢測 各組大鼠腹腔注射給予20%烏拉坦(劑量5 mg/kg)麻醉，斷頭取腦，于冰面小心剝離腦組織，分離前額葉與海馬，分別依次加入1 ml Trizol溶液，制作成組織勻漿。提取樣品總RNA，檢測濃度與純度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。每個樣本中加入ERK1/2引物，同時進行PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，55℃退火32 s，72℃延伸32 s，重復(fù)40個循環(huán)；72℃延伸5 min，ERK1/2 mRNA 5′-CGTTCAGATGTCGGTGTC-3′；5′-AAAGGAGTCAAGAGTGGG-3′，β-actin 5′-GCCGGGAA-ATCGTGCGTGACATT-3′；5′GATGGAGTTGAAGGTAG-TTTCGTG-3′。

1.2.6ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達水平的檢測 各組大鼠腹腔注射給予20%烏拉坦(劑量為5 mg/kg)麻醉，斷頭取腦，于冰面剝離腦組織，分離海馬，冰浴下制成10%的組織勻漿，于4℃下3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，按試驗試劑盒說明書測定蛋白表達情況。

2 結(jié)果

2.1糖水消耗試驗結(jié)果 給藥前，模型組、銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠蔗糖水?dāng)z入百分比顯著低于對照組(P<0.05)。給藥后，模型組大鼠蔗糖水?dāng)z入百分比顯著低于對照組大鼠(P<0.05)；與模型組比較，銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠蔗糖水?dāng)z入百分比顯著升高(P<0.05)。給藥后各組大鼠蔗糖水?dāng)z入百分比顯著高于給藥前(P<0.05)。見表1。

2.2大鼠曠場試驗結(jié)果 給藥前，模型組、銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠曠場試驗得分顯著低于對照組(P<0.05)。給藥后，模型組大鼠曠場試驗得分顯著低于對照組大鼠(P<0.05)；與模型組比較，銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠曠場試驗得分顯著升高(P<0.05)。給藥后各組大鼠曠場試驗得分顯著高于給藥前(P<0.05)。見表2。

2.3ERK1/2、p-ERK1/2 mRNA表達水平測定結(jié)果模型組大鼠前額葉與海馬p-ERK1/2 mRNA的表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠p-ERK1/2 mRNA的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；各組間ERK1/2 mRNA的表達水平不存在顯著差異(P>0.05)。見表3與圖1。

GroupsnPercentage of sucrose water intakeBefore administrationAfter administrationControl1083.36±7.3282.95±5.66Model1058.72±4.311)60.56±7.321)50 mg/(kg·d)GBE1060.41±5.201)72.80±5.612)3)100 mg/(kg·d)GBE1060.38±7.621)75.52±6.402)3)200 mg/(kg·d)GBE1059.41±5.841)80.12±4.372)3)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with before administration,3)P<0.05.

GroupsBefore administrationAfter administrationControl90.80±3.6192.20±2.30Model21.00±1.241)20.90±2.601)50 mg/(kg·d)GBE22.10±3.421)39.00±4.922)3)100 mg/(kg·d)GBE20.60±2.161)60.00±2.712)3)200 mg/(kg·d)GBE21.40±2.781)79.90±6.152)3)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with before administration,3)P<0.05.

GroupsERK1/2 mRNAPrefrontal lobeHippocampusp-ERK1/2 mRNAPrefrontal lobeHippocampusControl0.445±0.0450.521±0.0700,614±0.0420.780±0.034Model0.420±0.0710.559±0.1040.240±0.0141)0.212±0.0461)50 mg/(kg·d)GBE0.442±0.0540.562±0.0620.521±0.0932)0.613±0.0412)100 mg/(kg·d)GBE0.449±0.0800.541±0.0780.550±0.1042)0.687±0.0722)200 mg/(kg·d)GBE0.453±0.0520.545±0.9070.603±0.0752)0.731±0.0442)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

GroupsERK1/2 proteinPrefrontal lobeHippocampusp-ERK1/2 proteinPrefrontal lobeHippocampusControl0.517±0.0980.553±0.0620.478±0.0560.581±0.073Model0.537±0.1040.572±0.0910.201±0.0341)0.248±0.0301)50 mg/(kg·d)GBE0.554±0.0870.558±0.0730.354±0.0732)0.448±0.0832)100 mg/(kg·d)GBE0.523±0.0720.569±0.1220.405±0.0982)0.537±0.0512)200 mg/(kg·d)GBE0.530±0.1310.544±0.1140.432±0.0732)0.552±0.0592)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

2.4ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達水平測定結(jié)果 模型組大鼠前額葉與海馬p-ERK1/2 蛋白的表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠p-ERK1/2 蛋白的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；各組間ERK1/2 蛋白的表達水平不存在顯著差異(P>0.05)。見表4與圖2。

圖1 各組大鼠前額葉與海馬的ERK1/2與p-ERK1/2 mRNA表達(Western blot)Fig.1 Expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 protein in prefrontal and hippocampus lobe among each group(Western blot)Note:1.Control;2.Model;3.GBE low dose;4.GBE medium dose;5.GBE high dose.

圖2 各組大鼠前額葉與海馬ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(Western blot)Fig.2 Expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 protein in perfrontal lobe and hippocampus among each group(Western blot)Note:1.Control;2.Model;3.GBE low dose;4.GBE medium dose;5.GBE high dose.

3 討論

應(yīng)激是心理疾病發(fā)生的促成因素，可引起機體內(nèi)分泌失調(diào)以及神經(jīng)化學(xué)變化，抑郁癥的發(fā)生與應(yīng)激密切相關(guān)[8]。本研究采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激聯(lián)合孤養(yǎng)建立抑郁癥動物模型，經(jīng)過長期無規(guī)律的刺激，使大鼠處于心理紊亂狀態(tài)。葡萄糖作為神經(jīng)元的主要能力來源，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞受到損傷，對葡萄糖的吸收減少，葡萄糖攝取量的減少降低了神經(jīng)元細(xì)胞所需的能量，進一步加深了細(xì)胞損傷[9]。通過行為學(xué)評分表明，模型大鼠蔗糖攝入百分比、曠場試驗得分均低于對照組大鼠，反映大鼠的興趣與興奮度減弱，與抑郁患者臨床癥狀相符[10]，說明造模取得成功。

前額葉主要控制情緒變化和記憶學(xué)習(xí)能力，特別對快樂的獲得功能。海馬是調(diào)節(jié)情緒的重要腦區(qū)，也是應(yīng)激損傷的主要易感部位，慢性應(yīng)激主要通過HPA-Glu-NMDAR路徑對其結(jié)構(gòu)損害[11]。前額葉和海馬區(qū)作為與記憶、學(xué)習(xí)等認(rèn)知能力密切相關(guān)的腦區(qū)，在應(yīng)激過程中最容易受到損害。前額葉與海馬神經(jīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，發(fā)生退行性變化，使得神經(jīng)元細(xì)胞受損，容易引起抑郁發(fā)生[12]。因此，本研究選取前額葉與海馬腦區(qū)觀察ERK1/2的表達情況。銀杏酮酯能夠降低血清皮質(zhì)酮濃度，抑制血清和海馬炎癥細(xì)胞因子的含量，具有緩解模型抑郁樣行為的功效[13,14]。有研究表明，銀杏酮酯對神經(jīng)元有一定的保護作用[15]。ERK1/2大量存在于前額葉皮質(zhì)和海馬中，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，磷酸化ERK1/2是其活化的形式。本研究結(jié)果表明，低、中、高劑量的銀杏酮酯均可提高前額葉與海馬的p-ERK1/2 mRNA和蛋白表達水平，說明銀杏酮酯可以通過上調(diào)前額葉與海馬ERK1/2磷酸化水平，對神經(jīng)元細(xì)胞起到一定保護作用，緩解應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁樣行為。