邢 磊 趙樂樂 袁紅艷 張春華 陸雪林*

1.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海201103；2.上海欣灝珍禽育種有限公司，上海201408

微衛(wèi)星（SSR）標(biāo)記技術(shù)對(duì)加快畜禽性狀選育有很大的優(yōu)勢(shì)[1]，關(guān)于雉雞的分子標(biāo)記研究以前尚未有過，而且雉雞的基因組信息也是未知的。因此，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)以雉雞基因組為研究對(duì)象對(duì)雉雞的SSR 分子標(biāo)記進(jìn)行開發(fā)，構(gòu)建出雉雞SSR 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)，邁開了進(jìn)行雉雞分子標(biāo)記遺傳研究的第一步。通過設(shè)計(jì)特異性引物并經(jīng)過樣本群體的多態(tài)性驗(yàn)證[2]，得到了可靠的多態(tài)性SSR 標(biāo)記，旨在為雉雞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、基因定位以及分子標(biāo)記輔助育種提供分子水平上的有效工具[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于上海欣灝珍禽育種有限公司飼養(yǎng)的中華環(huán)頸雉（RN）、蒙古雉（MX）和國(guó)內(nèi)雉雞（D）的純種后代。3 個(gè)品種在同一雞舍、相同管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)。

1.2 血液樣本采集及基因組提取

第20 周時(shí)，從試驗(yàn)群體中隨機(jī)挑選105 只母雞采集血樣，各樣本翅靜脈取血3 mL，4% EDTA抗凝劑抗凝，-20 ℃保存。利用試劑盒法（天根生化（DP318）血液基因組提取試劑盒）提取血樣基因組，采用TBS380 結(jié)合picogreen 進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，再根據(jù)濃度檢測(cè)結(jié)果利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣本DNA 的完整性，電壓120 V，時(shí)間20 min。所得DNA 于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)及篩選

通過454 平臺(tái)高通量測(cè)序，利用MISA 程序在序列中搜索SSR 位點(diǎn)，利用primer3_2.2.3 對(duì)搜索得到的SSR 位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物。擴(kuò)增目標(biāo)片段為重復(fù)序列前1 個(gè)堿基到后5 個(gè)堿基的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在100～400 bp 之間。設(shè)計(jì)引物時(shí)，遵循一般的引物設(shè)計(jì)原則，并對(duì)PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度及范圍、引物退火溫度范圍、GC 含量、長(zhǎng)度等進(jìn)行嚴(yán)格限定，從而進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的調(diào)整。然后選擇分布均勻的SSR 位點(diǎn)通過90 個(gè)樣本逐級(jí)PCR 反應(yīng)篩選多態(tài)性位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中ddH2O 14 μL，10×Buffer 2 μL，DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.50 μL，dNTP 0.5 μL，Taq 酶0.5 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.4 微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型判定及數(shù)據(jù)分析

利用確定的8 對(duì)多態(tài)性SSR 設(shè)計(jì)熒光引物上ABI 3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，進(jìn)而進(jìn)行基因型判定并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用POPGENE3.2 統(tǒng)計(jì)觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）等。多態(tài)信息含量（PIC）用軟件LittlePrograme 計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過逐級(jí)多態(tài)性驗(yàn)證，最終確定8 條多態(tài)性SSR 序列，具體信息見表1。8 對(duì)微衛(wèi)星在所有雉雞個(gè)體中均能成功擴(kuò)增。

觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度見表2，多態(tài)信息含量見表3。由表2可知，RN 群體中，觀測(cè)等位基因數(shù)平均為5.38，每個(gè)位點(diǎn)從1（zll-12）到9（zll-30 和zll-68）不等，有效等位基因數(shù)平均為3.64。MX 群體中，觀測(cè)等位基因數(shù)平均為5.75，每個(gè)位點(diǎn)從2（zll-12）到10（zll-68）不等，有效等位基因數(shù)平均為3.65。D 群體中，觀測(cè)等位基因數(shù)平均為5.13，每個(gè)位點(diǎn)從2（zll-12）到11（zll-30）不等，有效等位基因數(shù)平均為3.45。對(duì)8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記群體雜合度計(jì)算結(jié)果（表2）顯示，RN群體平均觀察雜合度、期望雜合度、Nei 期望雜合度分別為0.60、0.60、0.59；MX 群體平均觀察雜合度、期望雜合度、Nei 期望雜合度分別為0.60、0.62、0.61；D 群體平均觀察雜合度、期望雜合度、Nei 期望雜合度分別為0.56、0.61、0.59。

根據(jù)表3 統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，8 個(gè)位點(diǎn)在RN、MX、D 三個(gè)群體中，除zll-12、zll-61 的PIC 小于0.5 外，其余6 個(gè)位點(diǎn)的PIC 值均高于0.5，說(shuō)明所選取的位點(diǎn)大多為高多態(tài)位點(diǎn)（圖1）。zll-30 與zll-68 的多態(tài)信息含量在3 個(gè)群體中均較高，zll-30 在D 群體中多態(tài)信息含量達(dá)0.89，zll-68 的多態(tài)信息含量在3 個(gè)群體中均超過了0.83。

3 討論

因?yàn)閲?guó)內(nèi)雉雞品種（D）和由美國(guó)引進(jìn)的原種雉雞2 個(gè)品種中華環(huán)頸雉（RN）和蒙古雉（MX）屬于同一物種，因此從3 個(gè)品種中隨機(jī)選擇國(guó)內(nèi)雉雞品種（D）的1 個(gè)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，從而得到雉雞所擁有的SSR 位點(diǎn)。雉雞并沒有基因組序列和注釋信息可進(jìn)行參考，只能按照無(wú)參考基因組序列的物種進(jìn)行SSR 分子標(biāo)記的開發(fā)，然后通過PCR 和一代測(cè)序試驗(yàn)驗(yàn)證方法篩選出可用的SSR 分子標(biāo)記。針對(duì)未知基因組信息的雉雞群體，采用454 測(cè)序平臺(tái)結(jié)合SSR 富集文庫(kù)測(cè)序的高通量測(cè)序方法進(jìn)行雉雞SSR 分子標(biāo)記的開發(fā)，很好地解決了近緣物種引物交叉擴(kuò)增所帶來(lái)的無(wú)PCR 產(chǎn)物的高風(fēng)險(xiǎn)，而且454 平臺(tái)能夠提供足夠的側(cè)翼序列用于特異性PCR引物設(shè)計(jì)[4]。SSR 富集文庫(kù)的構(gòu)建能夠減少測(cè)序數(shù)據(jù)量，降低測(cè)序成本，提高開發(fā)效率，分析手段目標(biāo)更明確、更經(jīng)濟(jì)、快速、高效，也為研究其他未知基因組信息的物種的分子標(biāo)記提供了思路和方法。

表1 多態(tài)性SSR 引物信息

表2 雉雞群體的等位基因數(shù)和雜合度

表3 雉雞群體的多態(tài)信息含量

圖1 三個(gè)群體中8 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC 含量分布

有效等位基因數(shù)越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻[5]。本研究中8 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在雉雞群體中有效等位基因數(shù)最小為1，最大為8.45，反映出8 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因在群體中分布不均勻。基因雜合度被認(rèn)為是度量群體遺傳變異的最適參數(shù)。雜合度越低，表明該群體遺傳一致性越高，遺傳多樣性也越低[6]。對(duì)于分子遺傳標(biāo)記，Helentjaris 等[7]提出用多態(tài)信息含量值（PIC）衡量基因變異程度高低、反映遺傳信息的多少。多態(tài)信息含量是等位基因頻率和等位基因數(shù)的變化函數(shù)。當(dāng)位點(diǎn)PIC＞0.5 時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)位點(diǎn)0.25＜PIC＜0.5 時(shí)為中度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)PIC＜0.25 時(shí)為低度多態(tài)位點(diǎn)。zll-30 與zll-68的多態(tài)信息含量在3 個(gè)群體中均較高。多態(tài)信息含量（PIC）和遺傳雜合度（He）都是表示群體內(nèi)遺傳變異的指標(biāo)。從保種的角度來(lái)考慮，我們要保持品種的遺傳多樣性，只有PIC 和He 數(shù)值大，才能說(shuō)明群體遺傳多樣性比較豐富。所以，由表2 和圖1 可知，本研究所選雉雞群體的遺傳多樣性非常豐富，這與雉雞的實(shí)際繁養(yǎng)情況相符合。因?yàn)閲?guó)內(nèi)雉雞養(yǎng)殖長(zhǎng)期處于散養(yǎng)狀態(tài)，并且沒有受到高強(qiáng)度的選擇。

4 結(jié)論

在雉雞生產(chǎn)中，雉雞羽色、頸環(huán)大小、產(chǎn)蛋性能等都是影響雉雞企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重要因素。采用傳統(tǒng)育種與分子標(biāo)記結(jié)合的選擇育種，可有效提高雉雞生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。本研究利用8 對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)雉雞群體進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，旨在為下一步指導(dǎo)雉雞分子育種提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。