海南花生果腐病菌的分離、鑒定及生物學(xué)特性研究

劉小玉 付登強(qiáng) 余鳳玉

摘要：近幾年，花生果腐病是花生上發(fā)生較為嚴(yán)重的一種病害，為明確海南花生果腐病病原菌的生物學(xué)特性，有效開展病害防治工作，降低該病危害，采用病原菌分離、鑒定，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究。通過對其培養(yǎng)特性、形態(tài)特征的觀察及rDNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，簡稱ITS）序列測定，與GenBank中同源性較高的菌株進(jìn)行序列對比，最后將菌株JGF2確定為鐮刀菌。生物學(xué)特性研究表明，JGF2菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長最快，菌絲生長的最適宜溫度為20～35 ℃，最適pH值為8，乳糖為最佳碳源，牛肉浸膏為最佳氮源。

關(guān)鍵詞：海南省;花生;果腐病;鑒定;生物學(xué)特性;轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

中圖分類號：S435.652?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0104-03

花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物之一，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，而近年來我國各大花生產(chǎn)區(qū)不斷受到植物病害的侵染，嚴(yán)重影響花生產(chǎn)量和品質(zhì)[1-3]。花生果腐病，別稱爛果病，主要表現(xiàn)在花生莢果腐爛，輕者半個莢果為褐色或黑色，里面的籽粒小而硬實，發(fā)育不良，嚴(yán)重者整個莢果都為深黑色，果皮和籽粒均已腐爛?；ㄉ≡谖覈鞔蠡ㄉa(chǎn)區(qū)發(fā)生，輕則減產(chǎn)20%，嚴(yán)重的減產(chǎn)80%以上，尤其是在重茬地塊，有逐年加重趨勢[4-5]。國內(nèi)外研究報道，花生果腐病的病原菌種類復(fù)雜，不同地域有不同的致病病原菌，目前我國山東[6]、河北[7]等地有花生果腐病病菌分離鑒定的相關(guān)報道，但海南花生還未見相關(guān)報道。鑒于果腐病對花生產(chǎn)業(yè)的潛在威脅，本研究通過組織分離法對海南文昌花生果腐病的病原菌進(jìn)行分離、鑒定，并對形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在明確病原菌種類，探明其發(fā)生傳播規(guī)律，為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 試驗材料 從海南文昌花生地采集5株地下莢果有黑色不規(guī)則病斑、地上部葉片脫落的花生樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基配制方法參考余鳳玉等報道[8]。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 采用常規(guī)組織分離法分離病原菌[9]。

1.2.2 致病性測定 按照柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)觀察 將純化后的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基平板上，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，觀察記錄菌落形態(tài)學(xué)特征。

1.2.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列測定 將分離菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后，收集新鮮的濕菌體0.1～0.3 g，用液氮在研缽中磨碎，裝入 1.5 mL 的離心管中，然后用基因組DNA快速提取試劑盒（真菌）提取DNA。利用通用引物ITS1和ITS4對病原菌的rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。并將PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。將該序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，采用BioEdit、Mega 5.0等軟件對菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 將活化的供試菌株用打孔器打成直徑為6 mm的菌餅，接種于直徑為9 cm的6種供試培養(yǎng)基平板中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每個處理重復(fù)5次，2 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6 pH值對菌絲生長的影響 用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到4、5、6、7、8、9、10、11共8個酸堿度。其他同“1.2.5”節(jié)。

1.2.7 碳源對菌絲生長的影響 以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中蔗糖分別用等質(zhì)量碳素的甘露醇、D-果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、阿拉伯樹膠粉、甘油等7種碳源替代，設(shè)置無碳作為對照，配制成不同的碳源培養(yǎng)基。其他同“1.2.5”節(jié)。

1.2.8 氮源對菌絲生長的影響 以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中硝酸鈉分別用等質(zhì)量氮素的蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、牛肉膏、磷酸二氫銨等5種氮源替代。設(shè)置無氮作為對照，配置成不同的氮源培養(yǎng)基。其他同“1.2.5”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離純化及致病性

從發(fā)病花生果殼樣品中，分離到5個分離物，用孢子懸浮液接種到花生莢果上，5株均產(chǎn)生與田間相似癥狀，其中JGF2致病性最強(qiáng)。從接種發(fā)病的花生病健交界處分離純化病菌，經(jīng)比較與原接種菌株在形態(tài)上相同，確認(rèn)所分離到的分離物為發(fā)病植株的病原菌。

菌株JGF2 25 ℃在PDA培養(yǎng)基上菌絲為白色，絨毛狀，顯微鏡觀察到2種不同分生孢子，大型分生孢子鐮刀型，稍彎曲，3～5個隔膜;小型分生孢子長橢圓形至卵圓形，無隔或1個分隔。依據(jù)Leslie等的方法[10]鑒定該病原菌均為鐮刀菌。

2.2 病原菌基因序列分析

經(jīng)rDNA ITS1和ITS4引物對菌株JGF2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條長度為595 bp的片段。將該序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）進(jìn)行同源性比較，基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1所示，菌株JGF2與鐮刀菌同源性高達(dá)100%，進(jìn)化分析聚在同一分支上，因此可以確定菌株JGF2為鐮刀菌。

2.3 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

菌株JGF2在6種不同的培養(yǎng)基上均能生長，但在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長最快，菌落直徑最大，2 d后均長滿平板，且菌落致密濃厚;其次為Richard培養(yǎng)基，菌落直徑為（8.0±0.8） cm;在瓊脂培養(yǎng)基上生長較差，菌落直徑最小，僅有（4.5±0.3） cm，菌絲也最稀疏。由圖2可知，菌株JGF2在不同培養(yǎng)基上菌絲生長差異明顯，PDA培養(yǎng)基最有利于菌絲的生長。

2.4 pH值對菌絲生長的影響

由表1可知，菌株JGF2在pH值為4～11條件下菌絲均能生長，其中pH值為8時，菌絲生長最快，長滿平板，而且菌絲生長茂盛、緊密;而在pH值為9～11條件下，菌絲生長差異不顯著。

2.5 碳源對菌絲生長的影響

2.6 氮源對菌絲生長的影響

由表3可知，不同氮源對菌株JGF2菌絲生長的影響顯著，最適宜的氮源是牛肉浸膏，長滿平板;其次是硝酸鈉，菌落直徑為8.1 cm;硫酸銨作為氮源菌落直徑最小，為2.7 cm，不適合該病原菌的生長;對照的菌落直徑為7.1 cm，但菌絲相當(dāng)稀薄，在生長范圍內(nèi)，培養(yǎng)基并未完全被菌絲覆蓋，而其他氮素培養(yǎng)基上，在生長范圍內(nèi)培養(yǎng)基被菌絲完全覆蓋，菌絲濃密。

3 討論與結(jié)論

隨著人民生活水平的提高，嫩花生作為鮮食食品越來越受大家的青睞，發(fā)展前景十分廣闊。然而，近年來我國各大花生產(chǎn)區(qū)不斷受到植物病害的影響， 特別是花生果腐病發(fā)病頻繁?；ㄉe稱爛果病，在多年重茬種植的地塊結(jié)莢期遇雨水較多時發(fā)病加重。由于常年高溫多濕的氣候影響，海南花生果腐病已成為花生的一種主要病害，對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響極其嚴(yán)重。本研究通過對花生果腐病病菌的鑒定，尤其是對其進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)特性研究，為該病害田間防治奠定理論基礎(chǔ)。

根據(jù)病原菌的形態(tài)學(xué)特征分析結(jié)果，花生果腐病病原菌鑒定為鐮刀菌。鐮刀菌尤其是茄病鐮刀菌在自然界中普遍存在，是多種植物及動物的致病菌[11-12]，能引起植物根腐、枯萎等癥狀，其產(chǎn)生的毒素不僅影響植物生長，也影響植物品質(zhì)[13]。本研究結(jié)果表明，從海南省文昌市采集到的花生果腐病主要是由鐮刀菌引起的，其鐮刀菌ITS序列長度為 595 bp，是否還有其他病菌與之混合侵染，需進(jìn)一步采樣分離鑒定。另外，本試驗生物學(xué)特性研究表明，菌株JGF2菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長最快，菌絲生長的最適宜溫度為20～35 ℃，最適pH值為8，乳糖為最佳碳源，牛肉浸膏為最佳氮源。

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